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肿瘤研究必备干货|Transwell迁移和侵袭实验总结之操作步骤
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Transwell侵袭实验原理 细胞侵袭实验是用基质胶（模拟细胞外基质）将高营养的培养液和低营养的培养液隔开。即：将癌细胞放在无FBS或含低浓度FBS的培养液里，为了吸收营养物质，细胞需消化基质后穿过膜进入含高浓度FBS的培养液，最终穿过膜的细胞量反应肿瘤细胞的侵袭能力。迁移原理同上，区别就是迁移实验不需要加基质胶。 侵袭实验步骤： 01 实验前准备 基质胶需提前一晚从-20℃拿到4℃冰箱（一般将其放在冰盒里然后再放入4℃冰箱），实验开始前2-4h，将灭菌好的枪头（200μL）和没拆封的Transwell小室放入4℃预冷。 02 小室制备 将基质胶与无血清培养液1：9稀释，需在超净台内冰盒上操作，混匀后每小室分别加60μL，操作时避免产生气泡，否则影响细胞穿透能力。放入CO2培养箱中静置2-4h，待基质胶凝固后，进行后续实验。 注：基质胶买来要分装，避免反复冻融。 每个小室内的基质胶不得有气泡。 03 细胞准备 将细胞状态良好的肿瘤细胞，胰酶消化法收集到离心管，离心5min, 1000rpm，弃上清，加1mL的PBS重悬后再次离心，弃上清，用无血清培养基重悬细胞，计数，8-10万/孔，待用。 注：穿透能力不强的细胞可以在实验前12h做饥饿处理，即将培养皿里的培养液换成无血清培养液。 04 接种细胞 24孔板加600 μL /孔（小室下层）30%FBS细胞培养液，每个小室内加入200 μL已计好数的细胞悬液(8-10万/孔，大多胃癌、肝癌、肺癌细胞8万/孔，结肠癌细胞10万/孔)，轻轻放入CO2培养箱中。 注：下层培养液和小室之间不得有气泡，否则下层培养液的趋化作用减弱。 05 培养细胞 一般选择12-48h，根据癌细胞的侵袭能力和细胞数量而定。胃癌细胞和结肠癌细胞48h合适。 06 染色并统计 48h后，取出小室， PBS洗一遍（轻柔），将小室放入新的已加入600μL的4%多聚甲醛的24孔板中固定20~30min；PBS洗两次，放入已加有600μL 0.1%的结晶紫染色液中染色10~20min，PBS或蒸馏水洗两次，用棉签擦净小室内部细胞，晾干拍照。 Transwell侵袭迁移实验，说难不难，按照步骤就能做出来，但说简单也不简单，师弟师妹们多次未果或者多次实验结果不一致。最后外包Omiget公司，结果还不错。预祝大家实验顺利！ |
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