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微笑漩涡新虫 (著名写手)
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[交流]
酶纯化问题求助
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最近表达了一个带有组氨酸标签的酶，用invitrogen的Probond purification system 进行纯化。纯化后碰到一些问题，希望有经验的大虫前来指教，不胜感激。 我的策略是，纯化后洗脱的8管1ml的小份儿先放在冰上，然后跑蛋白电泳检测哪管 是纯度较高的。检测结果出来后将纯度较高的那管用超滤或者透析的方法去盐。 然后于50%的甘油浓度保存于-20冰箱。 这里有几个问题不太肯定： 1、冰上放置时间的问题：在冰上放置3个多小时的时间酶活力会不会下降很厉害？ 为一水解酶。 2、超滤法去盐的时候如何操作：比如2ml样品离心剩余500ul，然后加纯水补足 2ml，再离心。这样重复几次可以去除250mM的咪唑？ 3、要是选择透析的话，2ml的蛋白样品是不是太少？损失会不会很大？ 4、选择透析的话，需要透析多长时间？16小时以上么？期间需要换几次缓冲液？ 请熟悉这块的高手前来指点。 |
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