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猫喝可乐

铁虫 (初入文坛)

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专业: 环境分析化学

[求助] qPCR问题求助

想麻烦各位科研大佬帮忙看一下，
科研小白刚开始做qPCR差不多一个月，
也已经跑出来过一些氮循环相关的基因如：noszⅠ、noszⅡ、nirK等，
目前在做的基因是amoA的古菌，但是遇到了一些问题解决不了，
已经做过多次重复实验，且qPCR程序是用之前师兄师姐设置好的，
且质粒和引物也是之前师兄师姐使用后没问题的（能跑出来），
目前的情况如下：
1、酶是takara的、引物是amoAF和amoAR这一对、稀释质粒是用的east dilution。
2、之前用AG的酶跑过，和Takara的情况一样效率很高但杂带很多。
3、考虑过是酶失活，但改进后无变化；考虑引物不是一对，改进后无变化。
4、考虑引物浓度太高导致非特异性扩增，跑pcr后发现条带较为单一，有不明显的引物二聚体。
5、在实验过程中的试管、水、枪头等均是灭菌干净的，且在无菌的通风橱中进行操作。
6、目前是质粒在扩增以后仍是非单一主峰，且样品也存在类似情况（如下图-左侧3列质粒、右侧3列样品），故考虑应该不是单纯的质粒问题。
7、发现稀释质粒在稀释倍数比较低的时候（稀释10、100、1000倍）溶解曲线的峰形单一且明显，但随稀释倍数增加出现非单一峰
8、样品基因丰度约在稀释质粒的3次方到5次方之间，且Takara的效率约在95-110之间。
p.s.下面为实验的结果，麻烦各位大佬看看有什么问题，万分感谢！
https://i.postimg.cc/kDP5F2cZ/20220406094707.jpg

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