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提DNA的一些心得
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提了DNA很多次，总是提不好，当信心降到最低点时，先后用了几个师兄教我的不同方法提，最近一次提的纯度比较高，有1ug/ul多，突破了ng级~ 综合了几个师兄的提法，我自己算是独创的方法吧，仅仅只是一些修改吧，现分享一下吧，我提的是真菌的DNA，所以提其它样品的DNA，就不能保证管用了~ 我用的是CTAB法： 1.液氮研磨（要研磨很细，才提得好）有些细节要注意，这是提DNA的关键。 2.用CTAB水浴30min，每隔6min混匀一次。水浴温度65度。 3.加等量的苯酚/氯仿，剧烈震荡，使混合均匀。15摄氏度，10000rpm，离心30分钟。 4加等量的氯仿再抽提一次。15摄氏度，12000rpm，10分钟。 5取上清，加0.8倍体积的异丙醇和0.2倍体积的醋酸钠，-20度冰箱静置30分钟。 6离心，12000rpm，15分钟。 7弃上清，用无水乙醇洗2次。 8在37度烘箱，烘干 9用TE溶解。 我的改进是第一次抽提用了30分钟，以前是用15分钟，抽提2次，转速的改进是用10000转，比12000转稍慢，这样可以抽提得更充分。我一般是用5mL的管提，也可以用1.5的EP管。菌丝和CTAB的比例是：0.2g菌丝加1mL CTAB,不过应该多加一些CTAB，裂解效果更好。 在抽提一次后，如果再加氯仿时，溶液比较浑浊，说明杂质很多，最好再抽提一次，比较好的状态是加入氯仿后，剧烈震荡后，从管底渐渐有细珠状的液体上升，很容易分层。 不过我的不足是，跑带时发现降解的比较多，可能是操作时间过长导致，虽然降解是不可避免的，但应该进一步摸索改进。 希望广大虫友提出更好的意见~ [ Last edited by xiangyuan7816 on 2009-9-5 at 19:55 ] |
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