外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十六） - 生物科学 - 细胞科学

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今天分享一篇梅奥诊所在预印本数据库bioRxiv上的文章，名为《Programmable Modulation for Extracellular Vesicles》[1]（追踪程序调控对外泌体分泌的影响）。

EV是细胞以一种非常保守的方式释放的膜封闭结构。迄今为止测试的所有细胞类型都能产生EV。它们广泛分布于血液、脑脊髓和其他体液中。EV在细胞之间携带生物活性分子，研究表明它们在病毒感染、癌症扩散、自身免疫和神经退行性疾病中具有生理和潜在的病理作用。EV通过旁分泌方式（向邻近的靶细胞）和内分泌方式（向远处的靶细胞）转移其蛋白质、脂质和RNA。由于这些独特的特性，EV相关的诊断和治疗应用正在进行深入的研究。

EV的产生和释放是一个受到严格调控的过程，在生理和病理条件之间发生变化。外部刺激可以很大程度改变EV的生产速率、含量或组成。然而，化学刺激缺乏特异性，而释放的囊泡异质性很大。理想的治疗性EV生产需要清洁和有效的监管。

哺乳动物的大脑产生内源性连续电场活动，细胞外电压小于0.5mV，电场电压小于5mV/mm。外部电刺激，使用侵入性或非侵入性电极来针对选定的大脑区域，是一种新兴的神经调节疗法。电压范围从0.5mV/mm~100mV/mm能够预防甚至逆转神经系统功能障碍，局灶性外部电刺激是FDA批准的治疗多种神经系统疾病的治疗方法。其作用机制的理论是，神经元活动可以被细胞外电刺激产生或阻断，不同的频率选择性地影响不同的神经元通路。有趣的是，许多电刺激疗法报告在长时间尺度上提高了疗效，如数月到数年。电刺激重塑神经系统的机制尚不清楚。我们现在报道的研究表明，EV可能是治疗性外部电刺激的介质。应用可编程的外部电刺激来控制EV及其内容物的释放适用于许多细胞类型。

作为原理的证明，选择研究星形胶质细胞，即中枢神经系统(CNS)中最丰富（比神经元多4-5倍）和异质性的胶质细胞。它们与Ranvier、血管和其他胶质细胞类型的突触相互作用使它们成为调节神经元的最佳位置。已知的功能包括调节突触连接、神经元网络的整合和同步，以及维持血脑屏障的完整性。它们通过升高细胞内钙浓度来对低水平的电刺激作出反应。在最初的测试中，发现环境电刺激影响了原代培养的大鼠星形胶质细胞的EV释放（图1）。使用绿色荧光染料钙绿素来监测星形胶质细胞的细胞质体积和囊泡挤压活性（方法和材料见补充1）。在电刺激(2Hz方波，脉冲宽度为0.1ms)时，在质膜上观察到外出芽和囊泡脱落。图1C显示了电刺激期间释放的EV的图像。通过逐步降低100mV/mm来确定应用场强度。我们发现大多数细胞在高场强下被杀死，但在~5mV/mm以下，大多数细胞在电刺激下存活。该电场的大小在海马体中神经元产生的内源性电场的范围内。

为了进一步确定电刺激波形对星形细胞EV释放的选择性影响，我们应用了三种不同频率的相同强度(5mV/mm)电场，用于人类治疗性脑电刺激，分别为2hz、20hz和200hz。事实上，这些频率也可分为由人类颅内脑电图(iEEG)记录的三个内源性脑电波振荡频率、delta（0.5-4Hz）、-伽马（>12-30Hz）和纹波（100-200Hz）。在这里，我们通过一个安装在100mm培养皿(图1A)上的定制装置，对星形胶质细胞培养物进行电刺激，旨在在星形胶质细胞上产生均匀的电场，通过连续的液体交换来收集EV。

为了详细表征EV，我们使用超滤结合尺寸排除色谱分离纯化收集EV，然后使用纳米流式检测仪(N30纳米流式检测仪，NanoFCM)量化EV的大小和表面蛋白质（见补充1方法和材料）。在这种情况下，我们使用AlexaFlour488偶联的AQP4特异性IgG单抗监测星形细胞特异性水通道蛋白4(AQP4)(图1D)。我们使用AQP4作为在不同刺激频率下收集的星形细胞EV对应的粒子数量和大小的指标。在没有施加电刺激的对照条件下，纳米流式图显示了两种不同大小的AQP4阳性EV的群体(图1E)。

通常，EV根据囊泡直径和释放过程可分为三类：外泌体、微囊泡和凋亡小体。外泌体是通过内吞体多囊泡体的胞吐作用释放出来的最小的囊泡(~50-100nm)。微囊泡，也称为外小体(~100-1000nm)，是由质膜向外出芽和脱落产生的。凋亡细胞释放凋亡小体(>1000nm)。我们将较小的囊泡解释为外泌体，将较大的囊泡解释为微囊泡。因此，我们得出结论，考虑到光学显微镜(>100nm)，我们在图1C中电刺激培养的星形胶质细胞下产生的囊泡很可能是微囊泡。

在本实验中，我们发现AQP4阳性EV的大小分布受到电刺激频率的不同影响（图2）。2hz刺激产生的EV分布接近均匀，尺寸分布峰值在~70nm，与没有电刺激收集的假定外泌体群体相比，略微向右移动（较大）。2Hz刺激产生的AQP4阳性外泌体的主要群体比基线时更明亮，这支持了2Hz刺激产生膜AQP4增加的外泌体群体的假设。与基础条件下相比，20hz的刺激产生的大、小尺寸的EV更少，特别是更少的假定外泌体。200Hz的电刺激与2Hz的刺激效果相反。微囊泡大小的EV占主导地位(峰值大小分布在~170nm)，该群体也在膜AQP4中富集。

诱发EV的特征表现出复杂的变异范围，这不仅取决于刺激的参数，还取决于星形胶质细胞培养的准备。我们测试了三个独立批次的培养星形胶质细胞，其制备的方法略有不同。尽管在准备和对ES的反应上有一些差异，我们调查了外泌体和微囊泡释放（其他数据见补充2）。电刺激下微囊泡增加(p<0.05)，但外泌体在不同频率下表现出更多变的效应。在不同条件下制备的细胞对外部电刺激反应的这种变化表明了未来使用电刺激进行精确治疗的潜力（见后面的讨论）。

RNA内容物是EV的一个重要特性。已知许多类型的应激会增加EV中包含的小的非编码RNA。因此，我们预计星形胶质细胞对低振幅电刺激的细胞反应可能会影响EV包裹的miRNA。我们采用了一种无偏不倚的方法来研究电刺激频率对miRNA谱的影响，通过使用RNAseq来识别EV miRNA的任何变化。我们分别从2Hz、20Hz和200Hz电刺激下施加均匀电场(5mV/mm)收集的纯化EV中提取RNA，利用逆转录技术将其转化为cDNA文库进行高通量测序。RNA-seq结果总结在维恩图（图3）中，详细信息列在表1中。我们共鉴定了89个miRNA。在四种条件下收集的每个EV样本中识别的miRNAs数量为：无电刺激，32个miRNAs；2Hz刺激，45个miRNAs；20Hz刺激，65个miRNAs和200Hz刺激，67个miRNAs。所有四组中均存在21个miRNAs，在没有电刺激的对照组中占66%，2Hz组占47%，20Hz组占32%，200Hz组占31%。总共有14种miRNA与电刺激特异性相关，而与刺激频率无关。然而，所研究的三种电刺激频率中的每一种都有一组独特的miRNA。

总之，我们已经证明了从培养的大鼠星形胶质细胞中释放的EV的数量、大小、表面蛋白和内容物受到电刺激频率的选择性影响。在基线（无电刺激）和在不同的电刺激条件下，培养的星形胶质细胞释放EV的特征取决于星形胶质细胞培养的制备。我们已经成功地测试了三批制备方法略有不同的培养星形胶质细胞。尽管实验数据范围有限，EV的释放也有一定的变化，但我们的一般结论是，电刺激可以选择性地调节EV的释放。事实上，在不同的生理条件下，电刺激对细胞的不同影响表明，正常细胞和患病细胞对电刺激的反应会不同。未来的方法可能只针对病变细胞，对正常细胞的影响较小，甚至没有影响。

在未来，我们还需要研究电刺激对脂质和其他星形细胞特异性蛋白的影响，如谷氨酸转运体和内向整流的钾通道。然而，从这项初步研究中出现的关键点是，电刺激为EV及其内容物的可编程调控提供了一种纯净的物理方法，这可能在生物科学和医学应用中产生广泛的影响。

我们报告的观察结果也提出了关于外部和内源性电调节EV释放的机制的有趣问题。首先，观察到的效应可能代表了一种基本现象，即可能与原始单细胞生命形式对外部电场的反应有关。这可能对哺乳动物大脑的大规模电活动可能发挥的生物学作用很重要。脑电图(EEG)显示了大脑内源性电活动的几个频带：（1-4Hz）、（>4-8Hz）、（>8-13Hz）、（>13-30Hz）、低伽马（>30-70Hz）、高伽马（>70-150Hz）和快速涟漪（>250-600Hz）。我们认为，局部场电位通过触觉耦合调节单个神经元的峰值时间。在哺乳动物的脑电图中观察到的最显著的变化之一发生在从清醒状态到睡眠的过渡期间，在那里脑电图活动变化到更高的振幅和低频率。电活动和行为状态的同时变化可能会影响被释放的EV及其内容物的组成。我们的研究表明，内源性细胞外电活性具有调节潜在的EV的释放和内容物组成，以服务于各种生物和病理功能。

其次，我们的研究结果表明，一种生物学上监测几种神经疾病的调节方法，如癫痫、睡眠和记忆功能障碍、脑肿瘤和帕金森病。经验表明，电刺激的频率是治疗特定神经系统疾病的结果的关键决定因素。对于帕金森性和特发性震颤，高频(>90Hz)可改善运动症状，但低频率(<50Hz)要么无效，要么可加重症状。相比之下，在一些癫痫研究中，低频刺激(<3Hz)安全有效地减少癫痫发作。频率依赖性电刺激治疗成功的机制仍在很大程度上是未知。监测脑脑脊液、血清或间质液（透析）中的EV谱可提供优化电刺激的生物标志物治疗，以获得更好的临床结果。

第三，研究结果提出了一种在体外通过调节电刺激参数来生产携带所需药物的治疗性EV的方法。与制备EV的化学方法不同，电刺激是一种纯净的物理方法，具有几个可调参数，包括振荡频率、场强和波形。

文章就分享到这里，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

bioRxiv preprint first posted online Mar. 3, 2019; doi: https://dx.doi.org/10.1101/566448.