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长夏123

新虫 (小有名气)

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虫号: 26151759
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专业: 药物分析

[求助] 体外肝微粒体代谢问题

我进行体外肝微粒体孵育实验，加入相应底物代谢后体系中一直检测不到代谢产物，我该怎么办，与没有做过的前辈指导一下

我的体系是这样配制的
                              0.1MTris-Hcl缓冲液：称取Tris3.03g加入150ml新沸冷水溶解，加浓HCL调PH至7.4,新沸冷水定容到250ml摇匀
                              1%的NaHCO3溶液：精密称取NaHCO3100mg，置于10ml容量瓶，加水溶解并稀释至刻度定容
                              0.15M MgCl2 溶液的制备：取2.86gMgcl2,加水溶解定容至200ml
                              启动子溶液(0.5ML体系)：称取NADP 10Mg，NADPH 5Mg置于同一EP管，加入0.5ml 1%的NaHCO3分装.放到－20保存，使用时放到冰上融化。配制过程冰浴。
                                 NADPH再生系统溶液（10ml体系）：一水柠檬酸28.55mg，异柠檬酸脱氢酶1.38ml，于小烧杯加0.15M Mgcl2溶液 0.95ml,  0.1M Tris-HCL 溶液9.05ml溶解。配制过程冰浴。完成后每1ml分装于1.5mlEP管中，约10管。置于-20°冰箱保存。用时解冻后使用。因为购买不到枸橼酸脱氢酶所以用异柠檬酸脱氢酶进行代替,体系不反应是这里出现问题了吗？
                              终止液：3mg氯雷他定溶于1ml乙腈，取100ul加入9.9ml乙腈。得30ng/ml得氯雷他定乙腈溶液10ML。每1ml分装于1.5EP管分10管。－２０°Ｃ储存


         1.5EP管中加NADPH再生系统189μL，人肝微粒体5μL（人微粒体蛋白终浓度0.5 mg/ml），加入1A2探针底物10000μM非那西汀溶液1μL，涡旋混匀1min。经37℃水浴预孵育5 min后，加入启动子溶液5μL启动反应涡旋混匀1min，继续水浴孵育20min。加入冰冷的乙腈400μL（含内标氯雷他定）终止反应。涡旋振荡3min， 13000rpm离心15min沉淀蛋白，取上清液后液相测定，底物减少的量,代谢产物生成量。平行做三组.
  有人指导一下吗，因为实验室就我自己也没有任何人指导都是自己摸索，也不知道哪里不对，求前辈们指导一下

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