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NanoFCMlxq新虫 (正式写手)
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[交流]
细胞外囊泡的常用表征方法有哪些？各有什么局限？
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这一期我来介绍一下细胞外囊泡的常用表征方法。 传统的EV表征方法有Western blot、蛋白组学、Elisa，还有用磁珠捕获流式检测的方法，但这些方法只能得到一个群体总体的信息，我们知道一个群体可能会有很多种分布组合方式，平均下来可能是一样的，那这些方法就没办法得到单个EV或者是某个亚群的信息。 那目前有没有实现单个EV的表征方法呢？这些就是目前常用的几种单颗粒表征技术。 像冷冻透射电镜，是可以直观测定颗粒的粒径和形态，但没办法测颗粒的浓度和荧光，并且测样过程比较复杂，费时通量低，仪器也比较昂贵，维护成本高；另外比较常用的是纳米孔技术和NTA技术，最低检测限都是70nm，NTA技术是通过对颗粒在二维平面的布朗运动进行追踪分析，根据方程计算颗粒的直径和浓度，由于颗粒实际上是三维运动的，所以会缺失Z轴方向的信息，导致结果偏差比较大。这个技术近年来也加上了荧光模式，但荧光模式跟散射光模式是分开检测的，两者信息无法一一对应，而且也容易造成光漂白；另外的纳米孔技术呢，它需要特定孔径的膜，而且是一次性的，拉一次膜就需要3个小时以上，而且样品缓冲液中的离子强度也会对检测造成干扰，也不能测荧光。还有一种方法就是流式细胞术，它有几方面的优势，比如说快速、定量和多参数，但存在灵敏度不足的限制，对于粒径小于200nm，荧光小于200个FITC分子，都是无法检测的。所以对于外泌体来说，传统的流式细胞术是没办法对单个外泌体进行检测，所以目前市面上就出现了一些用磁珠捕获外泌体，然后对磁珠进行检测的方法，但这种方法其实也是对一个群体进行表征了。 所以目前许多科学家也在尝试基于传统流式对EV的检测进行优化，这里参考了阿姆斯特丹大学的一位科学家的研究[1]，他用市面上主流的流式仪做了平行的对比实验，最后发现，即使是最灵敏的流式也没有办法检测到200nm以下的外泌体。并且值得注意的是，这些流式仪的检测下限通常都是用聚苯乙烯也就是PS球来确定的，而PS球的折射率与生物样本之间是存在较大的偏差的，一个100nm的PS球，它的散射光强度其实相当于180-190nm的EV。所以对于外泌体的检测可能有一定的误导。 下一期我会给你介绍EV检测的新技术，可以得到更准确更可靠的EV表征信息，敬请关注~ 参考文献：[1] van der Pol, E; Sturk, A; van Leeuwen, T; et al.Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation.[J].J Thromb Haemost.2018,16(6):1236-1245     发自小木虫Android客户端 |
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