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【资源】高效液相色谱仪使用遇到的问题
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高效液相色谱（HPLC）作为一种分离技术和方法，目前已经发展到一个全新的阶段。高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。作者本人从事液相色谱分析工作二十多年，应用HPLC技术在血药浓度、生物胺、核苷酸、蛋白质浓度测定等实际工作中，积累了许多的方法和经验，在这里与大家交流，希望能对同行们有所帮助和借鉴，共同促进液相色谱分析技术的发展。 1 高效液相色谱仪的基本工作原理 高效液相色谱仪如图1所示，是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。 高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]。 液相色谱仪是依靠色谱柱进行分离的。研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相（液相和固相）中分配“平衡”的过程。液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。当液体样品在载体流动相的推动下，在液-固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数（K）不同，则使各自的移动速度不同，即产生差速迁移。各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。 上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中，由于在两相中浓度的不同，而存在分配系数上的差异。 既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因，那么，必然地也会同色谱理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系，事实上，色谱理论中通常用容量因子k’的概念来反映物质在两相中的分配关系k’值可以非常方便地表达组分在两相的分配，又很容易从色谱实验数据中直接测得，是色谱理论中重要的基本参数之一[2]。 2 输液泵的常见故障及对策 输液泵/高压泵是保证HPLC系统流路畅通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件，目前多用往复式恒流柱塞泵，主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成，用马达带动凸轮驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。常分为单柱塞泵、并联柱塞泵、串联柱塞泵和柱塞隔膜泵等类型。流动相混合方式分为低压混合和高压混合。常见泵的故障主要有以下几种，并提供解决的办法。 2．1 单向阀故障 由于球与阀座密封不严，液体倒流，造成压力不稳，甚至球与阀座粘在一起阻死。密封不严主要是污染或气泡引起，球与阀座粘连也是由于污染和磨损造成。 为避免单向阀中的宝石球和阀座被污染，流动相应使用HPLC级的溶剂，并且配好的流动相一定要用0．45u滤膜过滤和脱气。如果泵被微粒污染，可分别用水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷依次冲洗。冲洗时应打开泄液阀，最后再用所用的溶液冲洗整个系统。 气泡进入阀中会紧贴在阀体的一侧，使宝石球难返回到阀座，引起倒流，泵的压力和流速会明显改变。此时，应立即打开泄液阀，大流量（2ml/min）冲洗泵，直至排除液为直线型。因为甲醇可润湿泵内壁，挤出气泡，故也可使用脱过气的甲醇冲洗泵。长期不用的泵或新装的泵头应该用甲醇赶气泡。泵进气泡也可在泵头上排气泡，即用扳手固定住进气泡的泵头，拧开输出管道的压帽，手动泵送液，可见到气泡从孔中挤压出来，直至无气泡排出将压帽拧紧[3]。 采取上述办法仍不能使压力稳定，应考虑是否密封垫坏了？或单向阀磨损、球不光滑等，需更换部件。 2．2 泵垫圈故障 泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统。液相色谱系统一般情况下不要使用强酸强碱溶液，因为这会损坏密封垫和柱塞杆。密封垫圈与运动着的柱塞杆紧密接触，可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来，它是液相色谱系统中最易磨损的部件。有条件的实验室可三个月更换一次垫圈，防止泵系统污染。如果用缓冲盐作流动相则更会加速垫圈的磨损，应及时冲洗。当垫圈损坏时，表现为：泵压力不稳、泵头漏液。一旦出现这个现象，应尽快更换新垫圈。 为避免上述故障的发生，我们在分析工作中应注意以下几点： ① 使用超纯水（18MΩ．cm）、纯度级别较高的试剂和色谱级溶剂配制流动相； ② 配好的流动相一定要抽滤脱气，即便仪器有在线脱气装置，也最好在上机前进行抽滤。真空抽滤既过滤颗粒也脱了气泡，非常有效。 ③ 泵在起动前一定要通过泄液阀抽净泵里的空气。 ④ 用缓冲盐洗脱时，分析结束后一定要用水冲洗泵和整个流路系统，不要让腐蚀性溶液滞留泵中，最后用有机溶剂充满系统。 3 色谱分离柱的使用与维护 在前述仪器工作原理部分，我们已经指出，液相色谱仪的分离是在色谱分离柱中实现的。我们目前工作中多采用反相色谱柱，如何保护好分离柱减少柱的污染是延长柱寿命的关键。 3．1 怎样维护好色谱分离柱 加保护柱（预柱）是保护分离柱的有效办法。保护柱是根内装填料与分离柱性质相近的短柱，接在分离柱之前，或代替流路过滤器。保护柱的作用是收集和阻塞分离柱口的化学垃圾，这些垃圾如果直接进入分离柱会逐渐堆积在柱头，最终降低柱效能。保护柱是消耗品，如分析血浆样品，一般分析50个样品后需更换新柱芯。 避免高压冲击分离柱。一般色谱柱都能承受得起高压，但经不住突然变化的高压冲击，这将改变柱床体积，影响柱效。引起高压冲击的原因主要有：进样器的样品阀的缓慢转动、泵启动太快、柱切换等操作。用手动进样阀时的压力变化不大，自动进样阀由于切换较慢，可能会造成压力冲击。 合理选择分离柱。我们知道，选择色谱分离柱主要根据两点，一是根据待测组分的分子量的大小；二是根据流动相条件，包括PH值、离子强度和溶剂极性等。传统硅胶基质的键合相柱要求流动相PH值在3-7之间，极端PH值（>8）的流动相能溶解硅胶，使键合相流失。而目前利用先进的杂化颗粒技术研制的高纯硅胶颗粒填料（如Waters公司的XTerra色谱柱），集硅胶和多孔聚合物填料的优点为一体，使有机硅烷单元取代了相当一部分占据颗粒内部和表面位置的硅羟基，使这种新型填料具有分辨率高、稳定性强、PH范围宽（1-12）的优势，其性能突破了传统高效液相色谱柱的极限。所以一定要根据分析的对象、流动相的条件选择合适的分离柱，茫然时可向公司的技术人员咨询。 定期冲洗分离柱。每次分析工作结束时，冲洗完缓冲盐后，最后要过度到用强溶剂冲洗柱子，如可用色谱纯甲醇、乙腈冲洗反相C18柱，目的是冲去吸附在柱上的强保留组分。如果用甲醇/水为流动相也应这样冲洗柱子，在一定程度上可恢复柱效。 3．2 怎样减少柱的污染？ 最有效的办法是纯化样品。我们在多年的分析工作中发现，凡是样品纯化的越干净，分离柱的寿命就越长；反之，只有提取没有纯化的样品，分离柱柱效下降较快。建立一个理想的色谱分析方法应该有一套有效的样品前处理方法，特别是在分析血浆和尿液样品时，要特别注意样品的提取与纯化，尽量使处理过的样品中杂质（如大分子蛋白、有机物等）降到最低，保护柱头和柱子。 提取纯化好的样品最好用流动相来溶解，一方面减少色谱图中的溶剂峰干扰，另一方面也是检查样品在流动相中的溶解性，如果样品进样后在流动相中沉淀，会堵塞进样器和柱头，甚至样品分解，出现怪峰。如果出现样品与流动相不溶要设法改变溶解条件，如更换样品溶剂，或改进处理样品的方法，或过滤，去除不溶性物质。 4 检测器的常见故障及对策 液相色谱仪常用的检测器主要有紫外、荧光和电化学检测器。这些检测器的作用就是收集流经色谱分离柱的各组分在检测器中的信号，根据组分光吸收值/荧光强度/电极表面电流的变化计算出组分的浓度[4]。各检测器常见故障主要有： 4．1 基线噪音较大和对策 对于紫外检测器，氘灯光源打开后要预热30分钟以上，基线才能稳定。 氘灯用的过久，接近受命期时（氘灯的寿命约束1000小时），会使基线噪音明显增加，应及时更换氘灯。除光源外，流路中的气泡也会产生噪音。怎样判断基线噪音增大是由于光源灯的老化还是来自流路中的气泡？可将泵关上，继续走基线，如果噪音立即停止，基线呈一条直线，说明基线噪音来自流动相中的气泡，应设法排气；若停泵后仍有噪音出现，应考虑是灯的问题。 电化学检测器中的工作电极（安培型）对气泡十分敏感，仪器的平衡时间较长。流路中如果有气泡存在，不仅基线会出现尖峰，还会影响检测。因此，做电化学检测时，流动相的配制要很严格，水要超纯、除还原物，配好后一定要过滤脱气，还应现用现配。如果泵系统不是PK材料，即电化学分析专用仪器，而是普通的高效液相色谱不锈钢泵，应对系统中的不锈钢材料的输液泵、进样器和管道，在分析前用6mol/L硝酸溶液钝化（注意断开分离柱），可缩短基线平衡时间。还可在流动相中加入EDTA离子隐蔽剂，也是可以的。如果有较大的气泡进到检测器中，光靠泵冲有时太慢，可暂时将泵停止，关上电化学检测器，拆下工作电极，用超纯水冲洗电极表面，也很奏效的，但对液相色谱技术不太熟练的技术员要小心操作，不宜反复这样拆卸。 4．2 检测器污染及对策 管道污染阻塞是检测器常见故障。当流动相用了缓冲盐更换流动相又不当时，常会在检测器管路中产生沉淀，可先用5倍柱积的水冲洗，再用10倍柱积的强溶剂（如乙腈）流过，再用50倍的柱体积的异丙醇冲洗，最后换上反相流动相平衡。当检测器管路堵塞时，可表现为柱压升高，此时，应和柱头堵塞相区分。可断开柱子，直接接检测器，如泵压仍较高，可判断压力升高是由于检测器管道堵塞造成。检测器进口是常发生阻塞的地方，正向冲洗效果常不明显，我们的经验是将检测器进出口管道对调，用6mol/L硝酸溶液反冲检测器，能很快将阻塞冲开，但要注意用低流速冲洗，观察压力变化。 检测池阻塞和污染多见紫外检测器。池阻塞也可用上述方法反冲，一般都能疏通。通常，池阻塞的故障比较少见，而池污染常发生，如不干净的样品在池窗上积聚等，都会造成检测池污染。表现为基线噪音增大，仪器灵敏度下降。可用注射器依此回抽异丙醇、6mol/L硝酸，要小心操作，将池中的污物冲洗干净，最后用100ml纯水正向冲洗检测池。反向冲洗还可防止池渗漏。对于电化学检测器，要注意维护工作电极表面的清洁度，当检测器检测了大量较脏的样品（如血浆、尿液）或用的过久，应用化学法或物理抛光法对电极表面进行清洁，可提高一定的检测灵敏度，但要注意，最后一定要用纯水冲洗干净，不要带来其它污染。 我们仅就有限的篇幅谈了一点从事液相色谱分析工作的经验，还有许多问题需要我们大家共同交流和探讨。高效液相色谱仪是现代科学研究中广泛使用的分析仪器，但我们必须学会正确的使用和维护，才能更好的驾驭它，让HPLC技术在医学领域发挥更大的作用。 高效液相色谱仪的几个使用问题 .1. 色谱柱中的流动相会排干吗？ 不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。 2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？ 如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。 bio.jewelove.net 使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。 使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。 3. 如何预防液相泵的故障: 要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施: 1).用高质量试剂和HPLC级溶剂； 2）、过滤流动相和溶剂； 3）、脱气； 4）、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液； 5）、不让水或腐蚀1. 色谱柱中的流动相会排干吗？ 不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。 2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？ 如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。 bio.jewelove.net 使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。 使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。 3. 如何预防液相泵的故障: 要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施: 1).用高质量试剂和HPLC级溶剂； 2）、过滤流动相和溶剂； 3）、脱气； 4）、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液； 5）、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中； 6）、定期更换垫圈； 7）、需要时加润滑油； 8）、查阅有关泵操作手册中的其它建议。 处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。在等度洗脱时压力波动小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。 为了使故障发生后尽快排除，平时应常备密封、单向阀（入口与出口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具。 生物学习之家 性溶剂滞留泵中； 6）、定期更换垫圈； 7）、需要时加润滑油； 8）、查阅有关泵操作手册中的其它建议。 处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。在等度洗脱时压力波动小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。 为了使故障发生后尽快排除，平时应常备密封、单向阀（入口与出口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具。 |
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