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719600567铁虫 (初入文坛)
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求助关于WB重复性差的问题。 已有2人参与
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我跑sd大鼠胰腺组织的yap及p-yap蛋白（65-78kd）的wb已经有好几个月了，期间偶尔跑出过一两次，但是重复性很差，经常是空白条带或者是一片灰。 关于我跑wb的一些细节。 1.用的是10%的胶，上样量是20微； 2.nc膜，转膜条件100v，100min，转膜后丽春红染色可以看见条带； 3.5%脱脂牛奶室温封闭1.5-2h； 4.一抗用的是cst的抗体按说明书配的1:1000，4摄氏度孵育过夜； 5.tbst洗5min*3次； 6.二抗用过1：1000和1：500的感觉差不多，该出不来还是出不来，确定种属是没有加错的； 7.tbst10min*3次； 8.ecl反应三分钟胶片曝光，压过半小时也还是没有，内参是有的。 想发图，但是这个论坛真的很难用诶？！ |
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2楼2022-01-18 22:57:35
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1:1000比1:5000浓度要高吧，但就算是这样也曝不出来；20微应该很够了吧，再怎么说也不应该什么都没有；因为是cst的抗体，所以还是很信任的，这个建议有待尝试，谢谢。 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2022-01-19 07:50:42
刘楠楠05
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4楼2022-01-19 09:10:45
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5楼2022-01-25 20:42:27
6楼2022-02-02 07:58:06
【答案】应助回帖
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1、上样量不应该用ul来衡量，因为蛋白浓度有浓有稀，对于难跑的指标首先可以考虑加大上样量，比如50ug，这50ug对应多少ul取决于你BCA获得的浓度，计算出来的，所以建议在提蛋白的时候尽量让蛋白浓度高一些，我一般会达到5-10ug/ul。 2、跑不出来可能真的是表达量低，可以用过QPCR看一下YAP在你的样本里的表达水平，同时可以网上uniport等蛋白库里找一下YAP在胰腺里的表达量 3、CST的抗体也不见得每个都好用，如果以上两点都确认过，可以考虑换个牌子试试，也可以发邮件找CST的技术支持，把你的实验条件和图片发过去，一方面寻求建议，一方面也可以要求售后 |
7楼2024-09-01 15:22:14
