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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 关于滚环扩增的问题求助
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mxc137

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于滚环扩增的问题求助

我最近在做滚环扩增产物与带有荧光基团和猝灭基团的茎环序列杂交的实验，通过让茎环打开，来实现信号的放大。但是我试了很多办法，几乎检测不到信号，甚至实验组比空白实验信号还要低。我检查了序列配对，没有任何问题。而我通过让茎环序列与它互补的单链结合，就会产生明显的信号，证明茎环序列是没有问题的。 我觉得是茎环序列没有与滚环扩增产物结合上。   所以希望各位能给点建议或指导，是什么原因导致的这个问题，或者说大家有什么意见或者建议，感谢大家的帮助和指导。

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1楼 2022-01-14 11:51:45
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
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怎么区分 （1）滚环复制已经成功了，探针结合不上，（2）滚环复制就没有成功呢？
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2022-01-14 12:13:34
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mxc137

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2022-01-14 12:13:34
怎么区分 （1）滚环复制已经成功了，探针结合不上，（2）滚环复制就没有成功呢？

结合上的话，荧光团会远离猝灭团，产生荧光信号。扩增成功的表现是可以通过凝胶电泳实验，观察到有明亮条带。目前是，有正确的条带，但是加入茎环序列后经过检测没有信号。

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3楼2022-01-14 14:41:46
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
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滚环复制产生的是单链还是双链，如果是双链，探针太短，无法和完全匹配的双链竞争，没有信号是正常的。
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行至水穷处，坐看云起时
4楼2022-01-14 15:52:19
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mxc137

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by pennchem at 2022-01-14 15:52:19
滚环复制产生的是单链还是双链，如果是双链，探针太短，无法和完全匹配的双链竞争，没有信号是正常的。

产物是是单链的，理论上，茎环序列是与产物完全互补配对的。

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5楼2022-01-14 16:03:10
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
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如果是phi29的话，反应温度是30°C？  探针和单链DNA结合也是这样的温度么？ 反应体系中有没有加入单链DNA结合蛋白？能否将反应产物纯化后，再加入探针看是否产生荧光？

反应是实时荧光（是不是观察窗口期太短），如果是反应结束后再加入探针观察，有没有可能反应时间太长，里面的单链已经不是单链（非特异扩增）

还有是否序列是否反过来了，探针和序列一致，而非互补（可能性很小，但也需排除）
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行至水穷处，坐看云起时
6楼2022-01-14 17:20:17
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mxc137

新虫 (初入文坛)
温度是相近的，不过没有加入单链DNA结合蛋白，因为需要进一步反应，连接荧光序列。我在想，能不能在进行进行扩增反应开始时，加入荧光序列，会不会好一些。

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7楼2022-01-16 21:50:29
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