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NanoFCMlxq新虫 (正式写手)
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纳米药物相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（一）
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今天分享一篇发表在ACS Nano（2021年IF=15.881）上的文章，名为《Light-Scattering Detection below the Level of Single Fluorescent Molecules for High-Resolution Characterization of Functional Nanoparticles》[1]（在单个荧光分子水平的光散射检测，用于功能纳米颗粒的高分辨表征）。 纳米技术的最新进展为开发有效的疾病诊断和治疗方法提供了绝佳机会，因为多种成像剂和治疗药物可以被纳入纳米颗粒(<100nm)中，用于靶向递送。由于这些功能纳米结构材料本质上是不均匀的，在单颗粒基础上进行高分辨率的物理和化学表征对于成功的临床转化至关重要。除了测量颗粒大小分布外，生化特性，如治疗剂封装的数量或偶联到单个纳米载体表面的靶向配体的数量需要进行分析，以对合成具有一致生物活性的纳米药物进行监控。然而，纳米尺度的尺寸和有限的装载分子数量使单纳米颗粒表征成为纳米医学发展的最大挑战之一。虽然单粒子技术在纳米颗粒的检测、大小和计数方面取得了显著进展，但通常缺乏对生化属性的同时评估。 流式细胞术(FCM)是一种成熟的技术，用于高通量、定量和单个细胞和微观颗粒的多参数分析。关于颗粒大小、形状和形态可以通过光散射检测来收集。而生化性质，如核酸含量、酶活性和生物细胞的抗原决定因素，可以通过荧光标记来表征。然而，传统的流式细胞术基于光散射检测直径小于200nm的颗粒是非常困难的。使用定制的流式细胞仪检测单个纳米颗粒和病毒已经付出了巨大的努力，直径为74nm的聚合物纳米颗粒是基于散射可靠检测到的最小粒子。 在光学技术中，弹性光散射是最简单和最直接的粒子检测方法，因为它不需要标签，适用于所有类型的材料，包括非荧光粒子和非金属粒子。虽然单分子荧光检测在实验室已经是常规操作，但单介电纳米颗粒，如脂质、聚合物、介孔二氧化硅和基于病毒载体的传递系统的光散射检测仍然是一个重大挑战。探测到这种粒子的困难有两个主要原因。首先，根据瑞利散射理论，对于尺寸远小于入射光波长的球形纳米粒子，散射光的强度与粒子尺寸有6次方的关系，散射截面(σscatt)由这个公式得出： 其中d为粒子直径，λ为入射光的波长，Nmed为粒子周围介质的折射率，m为粒子与介质的折射率比。这种强烈的尺寸依赖性使得非常小的粒子的散射光强在背景噪声以下迅速消失。例如，直径为25nm的二氧化硅纳米颗粒的散射截面(σscatt)在532nm处仅为0.0081nm^2，不到一些典型单发色团荧光染料的吸收截面(σabs)的1/3(1摩尔消光系数为68 000 M^(-1)cm^(-1)对应0.026nm^2的吸收截面)。第二，用于实现单分子荧光检测的技术，如光谱滤波检测斯托克斯位移荧光发射和时间检测延迟荧光光子自发散射光的排斥，不能将目标粒子的散射光与背景区分开来。为克服测量散射强度的六倍尺度定律，应用了干涉技术，将弱散射场与参考场相结合，检测到的信号随粒径扩展到三倍，而不是六倍。用干涉测量方法可以检测直径为30nm的单聚苯乙烯纳米颗粒和直径为10nm以下的单金纳米颗粒。 本研究提出了高灵敏度流式检测技术(HSFCM)的发展，该技术表明，通过直接测量散射强度，可以将直径小至24nm二氧化硅和7nm的金纳米颗粒弹性散射与背景区分开来。这种前所未有的灵敏度使高分辨率的纳米颗粒检测成为可能。通过同时荧光检测，对阿霉素封装化脂质体和小干扰RNA(siRNA)负载的脂质纳米颗粒的研究，证明了临床纳米医学的定量多参数表征的可能。 研究过程： 一、设备和检测方案 对纳米粒子进行灵敏的光散射检测的方法受到鞘流中单分子荧光检测策略的启发，即减小探测区体积，延长粒子传输时间以增加光子爆发量。然而，在我们早期的仪器设计中，用于荧光检测的单光子计数雪崩光电二极管(APD)探测器由于背景散射容易饱和，不能应用于单个纳米粒子的光散射检测。PMT探测器，检测100nm聚苯乙烯信噪比(S/N)最高达到104。当考虑到光散射与粒子大小的6次方的关系，为了检测介电纳米粒子直径小到几十纳米，需要显著提高灵敏度。图1a为当前HSFCM系统的设计示意图。简而言之，将一种纳米颗粒悬浮液通过锥形石英毛细管(40μm i.d.)引入一个方孔鞘流比色管的中心。高速鞘液流可以将样品流聚焦到一个非常细的流(～1.4μm)，穿过聚焦激光束的中心区域(直径～16μm，除非另有说明)，在那里辐照最均匀。每个纳米粒子以相同的速度通过激光束，经历相同的辐射场，从而为单个纳米粒子的定量分析提供了基础。垂直于入射激光器的光束和样品流，从样品流发射的光由无限校正的显微镜物镜代替模玻璃凝胶非球面透镜收集，然后由二向色分束器引导进入两条光路进行侧向散射(SS)和荧光(FL)检测。在每条光路中，使用聚焦透镜将激光束与样本流的相交图像投影到APD探测器上。硅APD探测器的活跃面积(直径～180μm)作为一个限制孔径，以排除从探测窗和鞘液流散射的激光。 通过对80nm的荧光二氧化硅纳米颗粒的分析，证实了SS和FL的同时检测，其荧光强度被校准为AlexaFluor532(AF532)的425个等效可溶性荧光色素(MESF)分子(图1b和支持信息图1)。每个通过探测区的纳米颗粒在SS和FL检测通道上都产生一个脉冲或爆发的光电流。对于每一次爆发，检测到的光子的总数被记录为爆发面积。S/N比值以1min内检测到的3551个纳米粒子的平均爆高除以背景信号（噪声）的标准差计算，SS和FL检测得到分别为486和561。还研究了激光功率对SS和FL的影响。虽然荧光的信噪比在大约5mW时达到最大值，此后随着荧光饱和而开始下降，但随着激光功率的增加，光散射的检测灵敏度继续增加(图1c和支持信息图2)。这些结果表明，较高的激光激发能量密度可以用来增强单个纳米粒子的散射光。 二、在低纳米尺寸范围内的单个纳米粒子的光散射检测 利用当前系统可用的最大激光功率(160mW)和直径～6.4μm的聚焦激光点，尝试对低纳米尺寸范围内的二氧化硅和金纳米颗粒进行单个纳米颗粒的光散射检测（支持信息部分1和图3）。图2a1中的代表性爆迹数据表明，直径为29nm的单个二氧化硅纳米颗粒(σscatt=0.020nm^2)，S/N比为27。对信号与背景噪声的良好区分得到了一个明确的SS爆发区域分布(图2a2)。对24nm的二氧化硅纳米颗粒(σscatt=0.0063nm^2)的光散射检测，S/N比为7，尽管它们的产光能力仅相当于0.3个AlexaFluor532分子（支持信息第3部分）。另一方面，由于二氧化硅（1.46）和聚苯乙烯（1.59）在532nm处的折射率差，二氧化硅纳米颗粒的散射光大约是相同尺寸的聚苯乙烯纳米颗粒的1/4。因此，本研究将～75nm的聚苯乙烯纳米颗粒的检测极限提高到～25nm的二氧化硅纳米颗粒，灵敏度提高了超过3个数量级。为了进一步证明HSFCM体系的灵敏度，我们分析了尺寸要小得多的金纳米颗粒。利用局部表面等离子体共振，分别检测到32个直径小于10.4和6.7nm的单金纳米颗粒，S/N比分别为53(图2c)和5(图2d)。我们将HSFCM在检测单纳米粒子的显著灵敏度归功于以下几个方面作用：（1）进一步减少检测体积～10fL，通过减少样品流直径和聚焦激光束点大小减少背景；（2）相对延长粒子停留在激光束(～0.3ms)和相对较高的激光激发能量密度(～5.0x10^5W/cm2或～1.3x10^24光子/s·cm2)的时间，产生更多的散射光子（～2x10^4对于24nm硅纳米颗粒）；（3）使用一个光子计数APD探测器实现高量子效率的光子检测；（4）良好的光学限制视场使得APD探测器可单独探测样本流，排除背景干扰。 三、基于散射光强度的单个纳米粒子的高分辨率尺寸分析 接下来我们通过分析5种不同大小单分散二氧化硅纳米颗粒的混合物，从40到90nm（支持信息图4），检查了HSFCM对不同纳米颗粒大小的分辨能力。为了避免大颗粒的APD饱和，并在样品流中提供更均匀的辐射场，将激光功率设置为16mW，聚焦激光束宽度为～16μm。一个典型的SS脉冲图显示，峰值高度聚集在五个不同的振幅水平附近，这对应于五种不同大小的纳米粒子群(图3a)。因为粒子分析速度可以接近100~200事件每秒，通过在1min内快速检测成千上万的纳米颗粒得到SS爆发面积的统计直方图，并且不同群基线分离(图3b)。值得注意的是，光散射对粒子大小的六次方的依赖性可能是一把双刃剑。一旦达到足够的灵敏度，10%的颗粒直径差异就意味着大约77%的光散射强度差异，从而实现对纳米颗粒尺寸的高分辨率检测。 当通过动态光散射(DLS)检测五种不同尺寸的二氧化硅纳米颗粒的悬浮液时，在尺寸分布图中观察到显著的重叠(图3d)。当通过拟合高斯曲线得到SS爆发质心(图3b)与通过透射电子显微镜(TEM)得到每群纳米粒子直径中位数(图3c)绘制函数，结果曲线表现出一个大约六次方的相关关系，非常符合瑞利散射理论(图3e)。利用这条校准曲线，通过计算SS爆发面积可以得到粒径，由此得到的尺寸分布(图3f)与TEM确定的尺寸分布非常相似(图3c)。透射电镜是最常用的纳米颗粒尺寸和形态表征的技术，但它不能在生物学相关的条件下操作，并且在产生大量统计数据方面的用途有限。通过提供快速(12min)和统计上可靠的纳米颗粒尺寸分布分析，HSFCM可以作为TEM方法的补充，用于功能纳米颗粒的常规分析和质量控制。这种技术的一个有益应用可能是纳米药物的临床前物理化学表征，包括测量其大小分布和聚集或团聚状态。 四、携带阿霉素的脂质体的粒径及药物含量分析 在纳米医学的发展中，纳米颗粒被用作载体来传递诸如治疗药物等有效成分；因此，同时检测纳米颗粒及其装载物是可取的。Doxil（携带阿霉素的脂质体）是FDA批准的第一个纳米药物（1995年），DLS和冷冻透射电镜是两种最常用的尺寸分析方法。为了评估将HSFCM应用于纳米药物特性的可行性，我们将物理特性和药代动力学与Doxil相似的聚乙二醇脂质体的研究级产品 Doxoves作为模型系统进行分析。图4a、b分别提供了Doxoves具有代表性的冷冻透射电镜图像和粒径分布直方图。在单个颗粒之间可以观察到大小和阿霉素含量的显著区别。通过统计椭圆形脂质体的长轴和短轴的平均值为62±11nm。值得注意的是，当阿霉素在脂质体颗粒内结晶时，其荧光与溶液中的游离药物相比会更易被猝灭。尽管颗粒尺寸小且荧光猝灭显著（～17倍，支持信息图5），图4c表明HSFCM足够灵敏，可以检测每个脂质体发出的散射光和阿霉素的内在荧光。在短短1个min中，分析了超过10 000 个粒子，可快速生成统计上稳健的分布(图4d)。值得注意的是，颗粒大小和药物含量在单颗粒水平上存在相关，并呈正相关。 由于二氧化硅纳米颗粒和脂质囊泡的折射率相当，我们使用单分散二氧化硅纳米颗粒作为标准来校准Doxoves纳米颗粒的尺寸测量值(图4e)，并在几分钟内获得了分布良好的高斯分布(图4f)。以这种方式测量的中位数与冷冻透射电镜测量结果吻合，而且更具有统计代表性。然而，值得注意的是，除了颗粒的形状，在一定波长下，脂质体的平均折射率是由其水含量和膜上脂质的折射率(488nm处～1.48)和囊泡中脂质部分体积决定的。阿霉素在脂质体内的包封和结晶也使问题变得复杂。因此，如果要使用二氧化硅纳米颗粒来精确校准不同的脂质体的大小，必须谨慎，因为可能会偏离真实值。然而，考虑到用于药用脂质体特性的方法非常有限，HSFCM具有相当大的优势，因为它可以在单粒子水平和悬液中快速同时分析粒径分布和药物含量。 五、基因传递系统中siRNA加载的粒子计数和片段检测 除了基于纳米颗粒的化药治疗，纳米颗粒介导的基因治疗在过去的二十年里，受到了相当多的关注。封装siRNA的脂质纳米颗粒(LNPs)是目前最广泛的经过临床验证的实现RNA干扰的手段。然而，确定精确的粒子计数和负载粒子的比例具有挑战性。虽然原则上可以在冷冻透射电镜图像中计算粒子，但在电子显微镜网格上，玻璃化样品中LNP分布的不均匀性使得很难获得精确的粒子计数。此外，空的和siRNA负载的LNPs具有相当的大小、形状和电子密度，这使得冷冻透射电镜在测定siRNA负载的比例方面效果较差。 我们实现了用HSFCM来表征siRNA负载的LNPs，其成分与目前用于临床试验的LNPs相同。siRNA加载LNPs和空的LNPs作为对照（Alnylam）。首先，使用80nm的荧光二氧化硅纳米颗粒作为内标，测量siRNA负载的LNPs(siRNA浓度为0.1mg/mL)的颗粒浓度为7.0x10^12颗粒/mL(图5a)。根据封装的siRNA的浓度和分子量(～13 500 Da)，计算出LNPs每个粒子平均含有～650个siRNA。这种单粒子计数方法简单（无需标签）且快速（分钟），并且不需要已知质量密度或规则形状。接下来，用空的和装载siRNA的LNP样品进行荧光染色分析。SYTO82是一种标记核酸的透膜染料。图5b显示，基于荧光信号，空siRNA和负载LNPs之间实现完全的区分，siRNA负载的比例约为100%。通过DLS测量，确定空LNPs和siRNA负载LNPs的平均尺寸分别为45±14和54±13nm。因此，LNP样品的SS爆发区分布非常广泛，很可能是由于粒径的较大的内在变化，由于粒径的六次方依赖，散射光强的变化可以显著放大。 结论： 综上所述，我们的研究首次证明，HSFCM通过直接测量散射光强度，可以对单个荧光分子水平下的单个纳米粒子进行光散射检测。最值得注意的是，采用鞘流系统来限制样品流，并将其隔离在远离流动通道壁的地方，对于探测体积减少和有效地阻挡来自比色管窗口的散射光是必不可少的。通过将单个纳米颗粒的光散射检测尺寸限制分别降低到24nm二氧化硅和7nm金纳米颗粒，HSFCM使分析以前难以表征的纳米颗粒成为可能。与其他新开发的单粒子技术相比，通过当前的荧光检测同时评估各种颗粒相关的生化性质是HSFCM的一个明显的优势。我们的研究结果将流式细胞术的适用性和通用性从微米和亚微米大小的粒子范围扩展到纳米尺度。除了纳米药物和其他合成纳米颗粒的特性外，我们预计HSFCM将为生物纳米颗粒的定量多参数分析开辟新的途径，包括病毒、细胞器、细胞来源的外泌体和蛋白质组装。 参考文献： [1]Zhu, S; Ma, L; Wang, S; et al.Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles.[J].ACS Nano.2014,8(10):10998-1006       发自小木虫Android客户端 |
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