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ArthurFSun铁虫 (小有名气)
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[交流]
293细胞生产重组蛋白，上清中检测不到 已有3人参与
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大家好， 请教一个问题。 最近我在用293F细胞表达带HIS标签的重组蛋白。培养体系是600 mL。我发现转染36小时后，用western blot和免疫荧光可在细胞内检测到有目的蛋白表达。但在转染后24-120 h的任何时间点，在上清中用 western blot却检测不到目的蛋白。用超滤管将上清浓缩10倍，western blot仍然检测不到目的蛋白。将转染后36h的上清挂镍柱，洗脱时没有出现目的蛋白峰。 请问，（1）上清中检测不到蛋白可以能什么原因？是因为蛋白不分泌吗？蛋白带有天然信号肽，理论上是应该分泌的。western blot检测不到是因为分泌量太低吗？扩大培养体系有可能检测的蛋白吗？ （2）我用的培养基的厂家说明书推荐细胞培养5天后收获培养基纯化蛋白，但是我发现，细胞培养48小时已经变暗，细胞数目也开始下降。请问有经验的前辈，293F细胞表达蛋白时，细胞密度多大时开始转染？转染后一般培养几天后开始纯化蛋白？ 谢谢！ |
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