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NanoFCMlxq新虫 (正式写手)
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2.生化和分子表征方法 在表3和图4中总结了这些方法。 （1）EV中RNA的表征 RNA是EV研究中最重要的生物分子之一。早期的研究分析了EV相关的核酸内容物，特别是小RNA、miRNAs和mRNA，已经揭示了RNA在细胞-细胞通信中的水平转移。从那时起，多种EV包含的miRNAs已被证明是各种病理条件的高度特异性的生物标志物候选物。miRNAs是研究最广泛的EV相关RNA种类；然而，许多其他RNA种类，如核糖体RNA、Y-RNA和tRNA片段，已经有报道，它们对功能分析很重要。总的来说，许多使用深度测序从各种生物液体和细胞类型中分析EV-RNA的研究表明，EV-RNA的主要部分包括小RNA(＜200bp)，具有异质亚群。在本节简要概述最广泛用于EV-RNA定量和全面分析的分析方法（图4）。 在UV-Vis法中，分光光度计，包括低体积检测细胞仪器(如NanoDrop)，可以通过测量紫外光吸收度有效地用于核酸和蛋白质的定量。然而，像NanoDrop这样的低体积检测细胞仪器的检测下限约为2ng/μl，对于来自EV中的RNA和蛋白质浓度较低的样本这可能会有挑战。由于EV亚群和含量是非常异质的，微体积紫外分光光度测量可能不准确，除非对一种特定类型的RNA使用适当的消光系数进行定量。 基于荧光的方法包括基于电泳的技术、RiboGreen分析和基于定量逆转录(qRT)-PCR的分析。 在基于电泳的技术中，微流控芯片用于对DNA和RNA等核酸的电泳分析。EV样品被裂解，并与核酸染料结合。不同长度/大小的核酸的分离是基于它们各自的电泳迁移率。浓度是根据电泳图中测量的荧光强度估计的。该技术的检测限较低，为50pg/μl（Agilent），适用于低产量的EV-RNA分离物。由于这种技术给出了RNA的大小分布概况，因此可以估计出各种RNA的相对数量。基于芯片的技术有一点要说明的是，RNA的质量通常使用rRNA标准来估计，而在EV亚群中可能没有全长rRNA。 RiboGreen检测采用了一种敏感的荧光染料，它与RNA的磷酸主干结合，并通过激发和发射波长产生浓度依赖的荧光信号。这些检测方法的检测限非常低，为1-200ng，并具有良好的线性，从而能够准确地定量。ISEV强调的这种检测方法允许使用荧光读板以高通量的方式测量EV-RNA的浓度。 当特定RNA或DNA序列的水平需要定量时，可以使用基于qRT-PCR的检测方法。该技术测量了荧光信号探针通过逆转录(RT)扩增到cDNA，然后使用序列特异性引物和PCR扩增cDNA。 优点包括低样本量（ul水平）要求，高灵敏度/低检测限（pg到fg水平），相对和绝对量化的能力，以及单个样本中多个基因的高通量（96/384孔板）的定量。之前的一些研究依赖于qRT-PCR对UC、过滤和沉淀分离的EV中的miRNAs进行了比较分析。有研究量化EV的数量和每个EV的miRNA数量之间的化学计量关系。从5个不同来源的EV-RNA样本中提取的基于qPCR的miRNA定量显示，平均而言，每个EV只有一个给定的miRNA分子(即使是最丰富的miRNA)。然而，与前两种技术不同的是，这种技术并不能测量RNA的总量，并且仅用于检测和定量已知的和特定的RNA序列。 第二代测序(NGS/RNA-seq)是最先进和最强大的核酸综合分析技术之一。先前的几项研究报道了小RNA测序在EV中的可行性和应用。该方法包括三个步骤：(i)文库制备，采用PCR扩增，RNA转录，DNA适配器连接，杂交到测序器上，测序器覆盖互补寡核苷酸序列，桥式扩增；(ii)荧光碱基合成测序；(iii)数据处理，涉及目标序列覆盖和与参考序列比对。RNA-seq的优势在于它能够识别和全面描述不同EV亚群中的RNA亚型。最近的一项研究利用NGS对人类胶质瘤干细胞释放的细胞外RNA(exRNA)进行了表征，发现MVs、外泌体和核糖核蛋白(RNPs)的RNA谱有很大的差异。此外，据报道，外泌体中miRNA种类的数量高于MVs或RNPs，这支持了将特定miRNA序列载入外泌体的假说。RNA-seq和微阵列在临床终点预测方面表现相似，但RNA-seq在检测低丰度转录本、区分生物学关键亚型和识别遗传变异方面更有效。RNA-seq NGS容易产生来自许多方面因素的偏倚，包括方法的选择，工具包，和供应商平台RNA分离，准备库、连接和测序(例如，HiSeq或MiSeq、SOliD、 Ion Torrent)，以及生物信息学路线和在标准化方法中数据处理的参数。此外，测序方法既费时又昂贵。 微阵列是一种成熟的技术，经常用于研究生物医学样本中数百个基因的全球图谱，并使RNA/DNA样本的差异分析成为可能。该技术基于DNA探针与样品中互补靶基因序列杂交的原理。探针以阵列格式，使用各种方法，如喷墨和微斑点结合在芯片上。在最近的一项研究中，使用微阵列结合NGS的数据对肥大细胞产生的EV-RNA进行了研究，显示了来自两个不同的exRNA特征[高密度(HD)和低密度(LD)exRNA]的四个不同的簇。皮尔逊相关性和主成分分析表明，在HD和LD部分中存在的不同结构对应着根本不同的RNA内容物。高通量和同时测量数千个mRNA转录本的基因表达或基因组DNA片段，以变异分析拷贝数是微阵列的主要优势之一。然而，根据实验目的和规模，一般会采用qRT-PCR来验证一些关键基因。微阵列的缺点包括成本高、需使用专用设备、大量基于低特异性序列的探针设计，以及对制造商微阵列平台设计的探针的分析选择的转录本池的依赖性。 NanoString是一种基因表达谱分析方法，已被用于研究EV-miRNA的生物发生及其机制，并识别多形性胶质母细胞瘤(GBM)和膀胱癌等疾病中生物液体中的生物标志物。该技术是基于将RNA与和目标基因序列互补的捕获探针的杂交。该探针在3‘端有一个生物素标签，可以将其固定在链霉亲和素珠上。目标基因也与荧光标记的报告基因探针互补，在5‘端具有独特的分子条形码。杂交步骤结束后，未结合的探针被洗掉，互补对被固定在一个载玻片上并成像。NanoString分析不计算条形码的强度，而是计算条形码的数量。NanoString与NGS和微阵列技术不同的是，该分析不涉及RT和扩增步骤，这消除了这些步骤引入的错误。此外，该技术比NGS耗时更少。利用装载wt-p53和miR-125b的透明质酸纳米颗粒来分析肿瘤miRNA含量。基于纳米链的miRNA panel已被用于研究不同的细胞表型。对细胞和EV-miRNA的综合分析显示，miRNA特征区分了GBM干细胞(GSCs)和GSCs衍生的EV，并进一步分离了细胞和EV的miRNA谱，这与之前确定的细胞的基因表达分析一致。然而，与NGS不同的是，NanoString使用了一组样本中已知序列的基因，这可能限制了对未知RNA序列的分析和差异分析。 综上所述，上述每种RNA图谱技术都有其独特的优缺点，可以与其他技术相结合，提供更全面的EV表征所需的信息。一篇ISEV建议文章总结了各种RNA检测方法对EV-RNA定量的适用性。下面列出了与EV-RNA特性相关的一些挑战。 一个挑战是可用的初始样本的数量。从各种RNA鉴定技术中推断可信的信息在很大程度上依赖于RNA的准确定量，而这反过来又取决于RNA的质量和完整性。与从细胞RNA中分离RNA的产量相比，EV的产量要低几倍，特别是在处理组织或患者样本时。 其次，大量研究表明，EV分离方法的选择同时影响了EV-RNA表征的数量和质量。 第三，一篇用各种生物液体进行小RNA序列的比较全面的研究，使用各种EV分离和RNA分离方法，表明一些变量如实验室之间的差异和RNA分离方法的选择是在目标RNA如miRNA的差异中最大的影响因素，并且不同的机制可能是不同RNA生物类型加载进入exRNA载体亚类(EV、RNPs和hdl)的原因。因此，应根据目标RNA生物型选择最佳的exRNA分离方法。 第四，从血液等复杂的混合物中分析RNA的一个挑战是能够检测到特定的RNA序列，因为携带一种RNA的多类EV可以是由一种细胞类型分泌出来的。此外，RNA类型的分布因生物流体和供体/细胞系的不同而不同。 一些实验指南和实践已经在各种出版物中提出，以标准化RNA特性。首先，评估EV-RNA的质量是其中最重要的标准化步骤之一。第二，另一个重要的步骤是评估与miRNA相关的载体类型(EV相关的vs脂蛋白相关的miRNA)。第三，应根据目标RNA群体，确定EV-RNA分离的最佳方法。与其他RNA分离方法相比，该方法应具有更高的高表达miRNAs比例和更好的重现性。根据一项评估不同EV亚型中的RNA的研究，外泌体中的RNA-蛋白质的比值明显高于MVs。因此，有一种可靠的EV分离方法来分离具有高重现性的目标RNA和EV群体是必要的。第四，证明蛋白酶处理后对核酸酶的保护作用是一种有效的方法，以确保给定的核酸被封闭在EV内，而不是粘附在其表面或共分离。第五，在功能测试中，建议进行细胞转染miRNA负载的EV，以评估miRNA的转移和miRNA的下游功能效应，如翻译抑制效应和转录水平的重编程。最后，在实验工作流程中应尽可能包括技术和生物重复。 （2）EV中蛋白质的表征 蛋白质是由EV运输的一类重要分子，是EV结构的重要组成部分（图4）。EV蛋白组成的分析是了解其生物发生机制及其功能的关键。为了实现EV蛋白鉴定的质量控制(QC)，该领域的专家建议证明至少存在以下类别的蛋白：与质膜和/或核内体相关的跨膜蛋白（CD63蛋白、CD81蛋白、CD82蛋白），以及EV中恢复的胞质蛋白[例如ESCRT-I/II/III和辅助蛋白ALIX、热休克蛋白HSC70（HSPA8）和HSP84（HSP90AB1）]。此外，也应证明在EV中，特定系统中缺乏共同分离APOs和高丰度蛋白（如血浆白蛋白）。 EV分离物中总蛋白量的蛋白质检测和定量：总蛋白测定法包括比色法、BCA和Bradford（考马斯亮染料）法或荧光试剂荧光法。这些检测方法的主要优点是能够使用读板器以一种简单、可靠和高通量的方式测量EV蛋白。然而，由于这些分析方法是基于特定氨基酸残基的标记，EV蛋白的组成可能会影响样品的定量。此外，当EV被高丰度基质蛋白（如白蛋白）污染时，可能会发生对总蛋白浓度的高估，从而降低了准确性。这是由于假设该分析的输出（每单位浓度的吸光度）在样品中的所有蛋白质中都是一致的。高丰度蛋白质与低丰度蛋白质的比例会导致高估或低估。 免疫亲和技术：免疫印迹和ELISA是传统的基于抗体的技术，可用于检测EV特异性蛋白，如四酯蛋白、MHC和上述通用EV标记物。在蛋白印迹的情况下，样品制备包括使用表面活性剂裂解EV样品，然后使用SDS-PAGE根据各种蛋白质的大小进行变性和分离。在这两种基于免疫亲和的技术中，特异性是通过使用抗体以高亲和力结合到目标蛋白上的表位来实现的。 Western blotting 耗时(＞10h)，但可以提供有关蛋白质大小和丰度的信息。相比之下，ELISA是一种更高通量的方法，因为它需要更少的处理时间(~4h)，以及使用96孔板。此外，这两种技术都因缺乏特异性/交叉反应性、不可预测的质量、保质期短和抗体成本高而有局限。 各种微流控方法也已经被开发出来。大多数人使用免疫磁珠通过结合特定的EV表面蛋白来捕获EV。一些微流控芯片的不同之处在于，它们将基于芯片分离的外泌体与各种蛋白质标记物的多路径分析相结合。 ExoSearch芯片技术在EV表征的其他方法上有几个优点。首先，通过在微升到毫升体积范围内应用一个连续的样品流，可以提供灵活的可扩展性。此外，当使用固定在珠子上的不同抗体时，可能会分离出特定的EV亚型。此外，对一个样本的多重免疫分析可以大大减少分析时间。 除了免疫磁性结构外，光敏剂免疫珠也可用于EV蛋白的表征。有研究将供体和受体珠引入了一种检测EV蛋白的发光接近试验，称为ExoScreen。链霉亲和素允许供体珠通过特定的生物素化抗体捕获EV。受体珠与第二种抗体偶联，该抗体将识别EV表面的某些表位，并被单线态氧激发并发出放大的荧光。 单EV分析(SEA)：目前，大多数的EV特性分析都是使用高度异质性的EV分离物进行的。群体分析的主要问题是，它们只提供了全局性质，而忽略了所研究样品的异质性。因此，SEA可以提供额外的信息。有研究介绍了一种使用免疫荧光显微镜的新的SEA方法。生物素化的EV首先被微流控腔内表面的NeutrAvidin捕获，用与目标抗体结合的荧光探针进行免疫染色，并成像。由于EV的固定，每次检测都能有更高的信噪比。此外，过氧化氢可用于成像后猝灭荧光团，以便进行第二轮染色成像。因此，实现了单个EV的多重分析。与传统的EV检测方法不同，这种SEA方法的结果显示，EV亚群包含有很不同的标记物。例如，最广泛使用的EV标记物，四酯蛋白CD9、CD63和CD81，分别只存在于4.8%、54%和26%的EV组分中。CD9和CD81也被认为是互斥表达的。因此，SEA是未来EV组成和功能异质性研究以及其他生物学探索的一个非常强有力的候选者。 微流控核磁共振(μNMR)：质子核磁共振(1HNMR)是另一种很有前途的EV检测方法。研究者设计了一个芯片上的μNMR检测系统，集成了免疫捕获与EV分析。微流控平台在μNMR检测前对EV进行了预浓缩，有助于提高检测灵敏度，这对于克服单独使用μNMR时由于EV的小尺寸而造成的灵敏度限制至关重要。为了通过核磁共振检测，我们使用磁性纳米颗粒(MNPs)通过表面特定的蛋白质标记物，如CD63来标记EV。通过磁标记，EV在核磁共振微线圈时变成超顺磁，导致加速衰减HNMR信号，其速率与系统中MNPs的数量成正比。因此，可以量化特定的靶向EV。利用该技术，对GBM衍生的EV与来自宿主细胞的EV进行了蛋白标记物的比较分析。这种μNMR传感方法具有一个独特的优势，即它减少了EV纯化的繁琐工作，因为生物系统中大多数自然发生的实体不是铁磁性的，因此很少引起干扰。 表面等离子体共振(SPR)：SPR传感也被用于EV的检测。SPR是一种依赖于金属传感表面上大量自由电子的光学技术，其中自由电子在入射光场的作用下（即称为表面等离子体的效应）集体振荡。金属膜上相邻介质RI的变化会改变等离子体共振频率，导致消光谱发生偏移，从而检测到目标物质的存在。基于SPR的EV蛋白分析通过使用一套周期性的纳米孔阵列，将传统的反射配置转换为透射模式，称为纳米等离子体外泌体(nPLEX)技术来改进。将各种捕获/探针抗体固定在传感表面，使EV能够以一站式的方式进行连续分离、探测和定量。透光率的光谱强度导致EV与传感表面的特定结合发生红移，这与捕获的EV表面的质量密度成正比，并可定量分析。此外，研究者将传感阵列与平行微流控通道集成，从而能够对多达12种外泌体亚型进行独立分析。与WB和ELISA法相比，nPLEX法具有更高的灵敏度，分别为104倍和102倍。nPLEX检测EV的下限为~3000计数(670aM)[180]。由于SPR的性质，nPLEX不会对分析物造成任何损坏，也不需要标记。此外，总分析时间可能小于30min，并且只需要几微升的样品。 电化学检测：电化学传感为EV中的蛋白质检测提供了另一种有前景的机制，通过放大氧化还原报告信号可以获得高灵敏度水平。最近，集成磁电化学外泌体(iMEX)正交检测将免疫磁分离/富集和电化学检测结合到一个单一的平台上，以产生快速和简化的EV分析，这只消耗了几微升的样品。磁珠首先用EV抗体功能化以进行捕获。然后，应用另一种辣根过氧化物(HRP)偶联抗体和3,3‘，5,5’-四甲基苯并胺(TMB)，即被HRP氧化后产生电流的底物，检测特定的EV标记物。iMEX也被用于检测尿液中T细胞来源的外泌体表面CD3，以监测肾移植患者的细胞排斥反应。磁富集过程，连同酶的信号放大，提供了高灵敏度。检测下限为~10^4囊泡，动态范围超过4个数量级。此外，该设备是一个便携式单元，包含8个独立的微流控通道，可以提供多路交换的、现场的临床EV标记物检测。通常，使用iMEX，一个完整的多重标记物检测分析可以在1小时内完成，并且只消耗10μl的样本。 与EV蛋白表征相关的一些挑战包括以下几点。目前，还没有特定的通用蛋白质集可以用于检测和表征EV和EV亚群。并非所有EV都来自同一生物来源；因此，EV亚群可能有与之相关的不同蛋白质表面标记物，并携带不同的蛋白质。此外，一些研究已经确定了特定的EV亚群蛋白标记物，表明EV可以根据其蛋白质含量进行分类。然而，这些研究使用了各种分离方法和不同的细胞来源。由于实验设计和方法的差异，与EV的每个亚群明确相关的特定蛋白质集仍有待确定。最后，检测到的蛋白丰度水平不能与EV计数直接相关。EV携带广泛的蛋白质，这取决于它们的来源和生物发生途径。 已经建议的一些实验性的指导方针和实践包括以下内容。首先，有人建议将APOA1/2、APOB和白蛋白（人或牛）用于血清衍生的EV以及从有牛血清培养的细胞中分离出的EV的阴性标记物。由于基质中这种高丰度的蛋白可以与EV共分离，因此建议报告这些需要消耗的标记物的水平，以达到EV分离的理想纯度。其次，为了鉴定每个EV亚群的特定蛋白，建议使用相同的生物来源和相同的分离方法，以确保分析的可重复性，以公平地比较。第三，在培养用于EV研究的细胞时，建议在添加细胞培养基之前，用无EV的胎牛血清(FBS)培养细胞。无EV的胎牛血清(FBS)已有市售；供应商往往不公开去除EV的方法。此外，无EV的FBS和培养基的储存和冻融条件可导致蛋白质聚集。因此，建议内部准备一套去除方案。 （3）蛋白质组学、代谢组学、脂质组学和多组学技术 蛋白质组学分析在EV研究中具有重要意义，而基于质谱(MS)的蛋白质组学技术是目前应用最广泛的技术。在AF4对EV亚类的分离研究中，使用nano-LC–electrospray ionization (ESI) MS/MS来分析每个类的特征蛋白。对这些蛋白质的功能分析显示， exomeres显著富含参与代谢过程包括蛋白质合成和碳水化合物代谢的蛋白质。Exo-S部分富含与膜囊泡生物发生和转运、受体信号传导和蛋白分泌相关的蛋白，而Exo-LEV部分富含与多生物细胞器组织、有丝分裂纺锤体和白细胞介素(IL)-2/Stat5和G蛋白信号传导相关的蛋白。基于MS的EV蛋白质组学分析的样本处理涉及几个步骤，通常需要数个小时，但该技术允许对成百上千个EV衍生的分析物进行高通量、比较、定性和定量研究（图4）。 除了蛋白质组学鉴定和定量外，翻译后修饰(PTMs)的分析可能会对EV的生物发生、内容物分类、生物标志物发现和摄取机制提供更深入的见解。凝集素微阵列和质谱均已用于EV糖基化分析，凝集素微阵列分析是无破坏性的，更偏向于特定类型的表征。虽然基于MS的糖组学技术目前只针对N-聚糖，但基于MS的方法能够提供信息来解译聚糖结构，包括基于碳水化合物的连接和组成。在卵巢癌细胞衍生的EV糖组学研究中，利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间/飞行时间(MALDI-TOF/TOF)，已鉴定出高甘露聚糖或复合型N糖聚糖(GlcNAc)、分离GlcNAc和壳二糖核心上的聚焦残基。LC-MS/MS是一种高效的磷酸化蛋白质组学研究工具。采用中性缺失扫描模式，精确定位了14个人尿源EV蛋白中的19个磷酸化位点。基于平行反应监测(PRM)的无标记定量质谱也被用于识别血液源EV中的磷酸化蛋白，作为乳腺癌的候选生物标志物。 SOMAscan是一种基于亲和的蛋白质组学分析技术，慢速率修饰的适配体用于人类血液和其他生物材料中的多重、高灵敏度和特异性蛋白质检测，在寻找新的蛋白质生物标志物方面发挥了重要作用。该平台应用于前列腺癌细胞衍生EV的生物标志物鉴定，发现了超过300种候选蛋白。SOMAscan还被用于对来自脑脊液(CSF)衍生的EV中的1128个蛋白进行相对丰度分析，以寻找中枢神经系统炎症性疾病的潜在生物标志物。SOMAscan的一个缺点是，研究结果在很大程度上依赖于数据处理算法和标准化，这可能会导致来自不同实验室的研究结果的严重不一致。此外，该方法依赖于结合试验的读取，这在很大程度上依赖于结合的特异性，这在生物液体等高度复杂的基质中可能会没有优势。此外，该方法仅限于定量表征一个特定的适配体和一个假定的目标分析物之间的结合，而无法通过结构表征来确认结合物的种类。 除了蛋白质和脂质成分外，EV代谢物也可能具有很重要的功能，代谢组学分析可以更深入地探究EV的结构特征。虽然EV代谢组学是一个新的领域，但由于通过EV，代谢物可以将EV作为营养物质和信号在细胞之间转移，因此其需求正在迅速增长。代谢物可以通过有机溶剂从EV中提取，根据其各种性质（质量、电荷、极性、疏水性）进行分离，然后使用质谱或核磁共振技术进行检测。一项研究表明，通过比较GBM细胞与其亲本细胞的EV，EV中存在活跃的代谢过程。然而，目前代谢组学的生物标志物很少。对EV及其起源的细胞和组织的代谢组学变化的探索有可能用于扩展临床诊断的工具箱。代谢组学的最新优势包括仪器提供的灵敏度，尽管这些方法可能昂贵且不容易获得。 利用基于MS的技术研究EV携带物，有助于更好地了解EV及其生物发生和结构特征。多年来，EV的蛋白质组学和基于MS分子谱研究一直存在一些缺陷。主要的挑战包括蛋白质的准确定量，PTMs的表征，以及运用多组学流程来表征EV和更好地理解EV的生物学特征。基于质谱的定量技术是很有前途的，一旦确定了适当的标准和目标蛋白/多肽，定量应该能够准确地进行。目前，数据依赖和靶向的蛋白质组学方法已被应用于解决定量相关的问题。一项研究使用串联质量标记(TMT)试剂对样本进行化学标记，与健康志愿者血浆外泌体相比，CRC肿瘤细胞释放的外泌体中有36个上调的蛋白和22个下调的蛋白。分析表明，上调的蛋白参与了转移的致瘤微环境。在一项代谢组学研究中，使用基于靶向的LC-MS/MS将前列腺癌患者尿液EV的代谢物与健康患者的尿液进行了比较。本研究为EV中富集的代谢物和以前从未实施过的新的标准化技术提供了基础。由于生物样品的丰度较低，EV蛋白质组学和代谢组学迫使人们在样品制备、数据采集和数据分析过程中需要新的技术。 结合蛋白质组学、代谢组学和脂质组学分析(a.k.a.多组学)可以提供更全面的EV分子组成信息，并对EV生物学和分类提供更深入的见解。基于MS的技术可用于识别EV中不同类型的小分子，包括不同类型的脂类、有机酸、氨基酸、糖和核苷酸这些小分子可以提供关于EV中所携带的不同生物标志物的重要信息。利用差速和梯度UC，脂蛋白可以根据各自的密度进行分离，HDL和EV落在样品管的底部，低密度脂蛋白向顶部迁移。这些组分包含各种种类的脂质，包括磷脂、甘油磷脂、鞘脂、胆固醇酯和甘油脂种类，以及其他蛋白质。对这些不同组分的分析表明，EV组成中蛋白质和脂质之间的相关性。研究表明，脂质在细胞生长的信号转导中起着关键作用，并促进细胞间信号转导。一种新兴的EV分析方法是耦合离子迁移率光谱(IMS)，在质谱分析之前，它根据离子在载气和外加电场(即碰撞截面和离子的电荷)中的迁移率来分离离子。这种方法可用于分析脂质、代谢物和聚糖，以前曾被用于研究病毒。将脂质组学、代谢组学和蛋白质组学与转录组学、EV形态和大小分布谱相结合，将获得对不同来源和类型的EV具体结构特征的最全面的了解（图4）。 六、结束语 在过去的十年中，EV研究领域的一个重大进展在很大程度上是利用现有的分析技术和有目的地开发了EV分离和表征的新技术。虽然这一进展导致了对EV结构特征、功能和生物发生的深入，但我们对EV的功能和机制生物学，以及它们与特定病理生理状态的相关性的理解仍然有限。此外，对每种EV和EV亚群的分子组成的详细描述仍然是一个挑战，主要是由于目前从生理液体等复杂基质中分离高纯度均匀EV及其特定亚型的技术的不足。替代方法，以及在不同实验室中使用的相似或相同的实验方法，往往会导致显著不同的EV分析结果。迫切需要改进EV分离和综合鉴定技术的性能和再现性。在多个实验室中设计和开展联盟类型的研究将加速使报告数据的实验方法和程序标准化的进展。改进的标准化技术将使EV类型的全面表征成为可能，并进一步提高我们对EV生物学的理解，以开发新的基于EV的诊断和治疗方法（图5）。 以下技术进步的领域对于更有效地推动EV的研究至关重要。在与生理液体中的EV相关的研究中，EV分离前的样品获取、收集和预处理是迫切需要进一步开发和标准化的关键领域。需要对标本收集的一套标准方案进行优化，以非常详细的方式记录，由几个实验室进行评估，并专门用于下游分析的几个主要工作流程(例如，蛋白质组学、转录组学、TEM)。这些方案应非常具体，包括要求和建议，尽量减少分析前变量，可能取决于禁食状态、水合状态、标本采集时间、生理液体类型（例如血浆、血清），以及标本收集、处理和储存的逐步说明（例如，抗凝剂或其他添加剂的选择、样品清理程序、离心时间和速度、储存温度和建议时间）。 对于EV的分离，优先事项包括制定基于形态学（即大小和形状）对总EV和特定EV亚群进行可靠和可重复性的分离方案，生物物理（例如，表面电荷、膜刚度）、生化成分（例如，膜性、非膜性、是否存在特定表面和可能的内部标记物）、生物（来源的细胞/组织）和功能（即特定生物活性）特性。此外，开发可重复和直接的可用于临床环境的EV分离技术是一个主要优先事项。最后，EV分离方法的小型化将使从有限的样本（例如，手指穿刺血液样本、纵向研究的存档样本、新生儿、儿童、动物、稀缺微针吸物、其他小型生物样本）中有效和稳健地分离，也是高度优先事项，以实现潜在的快速和敏感的诊断应用。可能需要开发新的分离模式，以实现上述应用领域所需的高效EV分离。稳健的分离方案还将提高批次间的再现性，并有可能解决EV样品中的一些异质性问题。 对于EV作为药物传递载体的应用，诸如TFF和SEC等大规模制造的EV分离技术被用于生产临床级EV。在这种情况下，开发cGMP协议，包括对一些过程参数的彻底表征，如母体/源细胞类型、生物反应器条件和色谱条件，对于了解最终产品的CQAs和重现性至关重要。当确定了这些CQAs时，需要实现一个变量的可接受范围，如定义的尺寸、纯度、表面标记轮廓、内容加载和标识，以进行发布测试，并了解EV制造过程的批间差异和一致性。 在EV的生化表征方面，以下能力似乎特别引人注目：对各种特性、起源和功能的EV群体进行详细的分子分类；EV蛋白的PTMs的敏感定量表征（如糖基化、乙酰化、磷酸化）；来自同一标本的同一EV分离物的信息多组学特征；有限EV分离物的高灵敏度深度分子谱样本（指刺血液样本、新生儿标本、泪液；见上述例子）；以及EV分离物、未处理生理液体（如全血、脑脊液）、最低处理生物液体（如血浆、血清），甚至来自生理液体的存档样本，可以高灵敏度和特异性检测和定量其他无关EV群中的罕见EV。 NGS等测序技术的进步有助于理解EV转录组的异质性。然而，仍然需要对EV样品分析中所涉及的复杂工作流程进行标准化，因此该过程在各个实验室中都是稳定的和可重复的。这些先进技术的信息应该能够根据RNA种类的类型提供分析方法的选择。虽然EV鉴定中的高性能转录组学方法已经成熟，但蛋白质组学、脂质组学和代谢组学方法在性能、再现性和坚固性方面尚未赶上。以下新的分析技术尤其有希望使EV研究的进一步进展：SEA；高分子质量大分子复合物的完整大分子结构，包括完整的EV；以及高分子质量大分子复合物的电荷检测质谱，可用于单个EV的表征。此外，直接明确的EV特性分析（如完整EV成像、质量和/或电荷、ζ电位分析、基于免疫亲和的SEA）的分子谱分析相结合，将有助于未来EV研究的发展（图4）。 此外，进一步推进数据解释和多参数数据分析，可以包括病人的多个层次的信息，病人自己的和家庭健康史和个人元数据，病史，样本收集、处理和分析条件和结果也对进一步发展EV领域的研究和应用至关重要。 综上所述，EV研究的各个方面的进展，如分离、分析表征和方法的标准化，将大大提高对EV生物学和携带物的机制理解。这些见解可以帮助进一步将EV应用于有效的诊断目的和治疗策略。 文章就分享到这里，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~ 参考文献： [1]Gandham, S; Su, X; Wood, J; et al.Technologies and Standardization in Research on Extracellular Vesicles.[J].Trends Biotechnol.2020,38(10):1066-1098     发自小木虫Android客户端 |
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4楼2022-02-14 14:34:13
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