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NanoFCMlxq新虫 (正式写手)
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外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十三）（上） 已有2人参与
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今天分享一篇发表在 Trends in Biotechnology（2021年IF=19.536）上的文章，名为《Technologies and Standardization in Research on Extracellular Vesicles》[1]（细胞外囊泡的技术与标准化研究）。 细胞外囊泡(EVs)是一种磷脂双层膜封闭结构，包含RNA、蛋白质、脂质、代谢物和其他分子，由各种细胞分泌到体液中。EV介导的生物分子转移是各种生理和病理过程的重要组成部分。EV在新的诊断和治疗策略中的潜在应用已经引起了越来越多的关注。然而，由于EV固有的复杂的生物发生以及它们在大小、组成和起源上的巨大异质性，其研究仍然具有很高的挑战性。有必要建立标准化的方法来解决EV的异质性和EV研究中分析前和分析多样性的来源。在此，我们回顾了为EV分离和表征而开发的技术，并讨论了EV研究的标准化路径。 一、EV的生物发生、生物学意义和应用 EV是一种磷脂双层膜封闭的生物实体，存在于多种生理液体中。EV由各种类型的细胞分泌，携带来自其亲本细胞的重要生物分子。EV的生成涉及多种生物发生途径，根据这些途径，EV可细分为几种类型，包括外泌体和微囊泡(MVs)。外泌体(~30-150nm)是通过核内体膜向多囊内体(MVEs)成熟过程中向内出芽产生的，而MVs(~100-1000nm)是由质膜向外出芽形成的。然而，它们仍然有几个共同的特征，包括：脂质和蛋白质聚集在核内体/质膜上；通过各种分选机制隔离胞质核酸、蛋白质和其他生物分子，然后使小囊泡出芽和裂变；以及涉及对接、融合和摄取的细胞间运输。凋亡过程中形成的囊泡大于1000nm，称为凋亡小体。最近创造的术语“外膜”描述了最小的(＜50nm)非膜结合纳米颗粒和更大的大分子复合物，也可以包括在总的术语“EVs”下。 分选机制在涉及的细胞内复合物方面是多种多样的，可以大致分为两种主要途径，依赖运输所需的核内体分选复合体(ESCRT)和非依赖ESCRT。ESCRT依赖的机制是逐步发挥作用的，其中一系列ESCRT亚复合物(如TSG101、CHMP蛋白)参与其中。非依赖ESCRT的途径涉及神经酰胺依赖途径，该途径产生膜亚结构域和四酯蛋白，如CD63、CD81和CD9，在膜上形成簇，诱导囊泡向内出芽和EV的形成。此外，细胞质蛋白，如热休克70kDa蛋白(HSP70)，被归于来自大多数细胞类型的外泌体中。核酸(DNA、mRNA和miRNA)是EV携带的另一种重要的分子。miRNA的分类是序列依赖的，导致特定miRNAs在EV中的差异分类。总的来说，EV的形成有多种途径，导致异质种群的释放，可能在大小、组成和功能上存在很大差异。到目前为止，仍然很难根据分离的囊泡的亚群来确定一个特定的途径。因此，显然需要更好地理解区分EV的生物发生、分类和释放的因素。 国际细胞外囊泡协会(ISEV)推荐使用“EV”作为这些类型的囊泡的总称，因为很难将EV分配给特定的生物发生途径，除非通过实时成像技术在释放过程中被捕获。ISEV还建议根据EV的物理特征进行分类，如大小和密度、不同的生化组成和表面电荷量。 一旦EV被释放到细胞外空间，它们就会被受体细胞内化（内吞、吞噬或微胞吞作用），然后转移EV的遗传物质和蛋白质，进一步与靶细胞的细胞信号通路相互作用。EV用于在免疫细胞[树突状细胞(DCs)、B细胞、T细胞]之间传递信息，从而对免疫应答产生免疫抑制或免疫激活作用。中枢神经系统(CNS)的细胞使用EV作为信号传递到其他神经元细胞的主要途径。更重要的是，EV已被发现在神经退行性疾病如帕金森病和阿尔茨海默病在中枢神经系统的解剖连接区域之间的传播中起作用。在心血管系统中，心脏成纤维细胞EV富含miR-21，这是心肌肥厚的重要旁分泌信号中介。此外，据报道，肿瘤来源的EV在癌症的标志中发挥作用，如肿瘤生长、侵袭性、避免凋亡、免疫细胞调节、抵抗和转移。 EV携带多种生物物质，被认为反映了亲本细胞的生理状态。EV的成分已经在病理生理状态的探测中被研究作为疾病诊断和监测的潜在生物标志物。例如，来自结直肠癌(CRC)患者血液样本的上皮来源EV的miRNA分析显示，与健康个体相比，13个EpCAM+-EVmiRNA水平升高。此外，I期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的EV miRNA图谱能够区分癌症的不同阶段。在蛋白质方面，我们发现CD147在CRC细胞系分泌的EV以及CRC患者的血清中富集。癌症患者中CD9和CD147均呈阳性的EV水平显著高于健康供体。尽管这些研究突出了EV的诊断潜力，但EV分离和鉴定方面的挑战直接影响了EV生物标志物的特异性和敏感性，以及它们转化为强大诊断工具的能力。 EV已被用于运输多种治疗分子，如siRNA、miRNA和小分子。各种方法，如转染、孵育、超声处理、循环冻融和电穿孔处理，已经被开发出来用于装载这些分子。装载方法的选择取决于装载分子的类型；例如，对于小的非编码RNA(siRNA和miRNA)，分离前转染亲本细胞和分离后电穿孔是目前首选的方法。小分子抗癌药物如阿霉素和紫杉醇可通过孵育被纳入EV，并在临床前研究中显示了增强的抗肿瘤活性。与其他传递载体相比，工程EV提供的一个独特优势是能够整合配体，它可以特异性地靶向癌细胞并逃避免疫反应。Kalluri实验室已经表明，装载siRNA的CD47+EVs仅靶向KRAS突变的肿瘤，与携带类似数量的的脂质体相比，显示出更高的治疗效果。来自Amiji实验室的研究者使用了一种新的方法来调节来自癌细胞的EV miRNA含量，将巨噬细胞从M2（原肿瘤）重新编程为M1（抗肿瘤）。此外，EV免疫信号已被用于产生抗肿瘤作用。最近的一项研究调查了DC衍生的EV与或不与程序性细胞死亡-1(PD-1)抗体一起使用索拉非尼治疗肝细胞癌的潜在协同效应。基于EV作为药物传递工具和免疫疗法的潜力，一些公司，如Capricor Therapeutics、Codiak Biosciences、Evox Therapeutics和Puretech Health，已经开始了产品开发工作，将EV疗法转化为临床。在https://ClinicalTrials.gov网站上搜索关键词“外泌体”或“细胞外囊泡”，可以发现一些临床试验，这些试验正在招募各种类型疾病的患者，包括几种类型的癌症、神经退行性疾病、焦虑、糖尿病和covid-19。由于亲本细胞抗原的表面表达，DC衍生的外泌体已被用于疫苗传递，并在不同类型癌症的多个I期试验中被证明是安全的。在II期临床研究中显示了一些有希望的结果，使用这些负载肿瘤抗原的EV作为抗NSCLC联合环磷酰胺的疫苗。尽管EV的治疗应用取得了这些有趣的进展，但在将EV治疗转化为临床方面仍存在一些挑战。其中一个主要的挑战是亲本细胞通过各种复杂的生物发生途径产生EV固有成分的异质性。这种异质性可导致EV大规模生产的批次内和批间差异。为了将EV成功转化到临床，识别影响产品效力和稳定性的关键质量属性(CQAs)（如大小、纯度、分子组成）是必不可少的。 这篇综述全面概述了EV分离和鉴定的传统和新兴的方法，以及这些方法所面临的主要挑战。此外，还强调了实现所讨论方法的标准化的可能途径，并确定了这些技术在推广和标准化方面的潜在好处和缺点。这对已发表报告和对这些方法优缺点的严格评估将帮助读者了解当前EV研究和确定最有效的路径选择，在未来的相关研究领域的研究中实现和标准化感兴趣的特定技术。 二、EV分离：挑战和需求 1.EV的来源：EV的异质性和复杂性 EV可从各种生理液体中分离出来。血液是EV最丰富的来源之一，估计浓度为5-15×10^8颗粒/ml。从血液中分离EV的一个挑战是它含有脂蛋白[＜35nm，密度1.06-1.20g/cm3，极低、低、高密度脂蛋白(VLDL、LDL、HDL)]和乳糜微粒[75-1100nm，密度＜0.930g/cm3；a.k.a.超低密度脂蛋白(ULDLs)，它在大小和密度上与EV重叠，不能通过传统的方法分离(例如，超离心(UC)]。其他影响血液中EV的数量、纯度和异质性的因素包括样本采集、处理、储存条件、稳定性、抗凝剂、采血量、采血时间、动物/患者的年龄、性别、疾病状态和喂养/禁食状态。在晚期卵巢癌的病例中，会出现出血性恶性腹水，其中包含各种细胞类型分泌的大量EV，以及细胞、胞质成分和细胞外基质(ECM)片段。这些额外的成分不仅影响EV亚群体的化学成分，而且还改变了其物理性质，如血液的粘度，增加了分离高纯度EV群体的难度。进一步的异质性来自于从细胞中释放出来的各种囊泡的生物发生。 2.规模化和通量 大多数用于EV分离的传统实验室级别的方法都采用了多个分离步骤，这给大规模生产带来了挑战，而且通量很低。近年来，切向流过滤(TFF)结合基于色谱的方法已被开发出来，用于大规模的基于cGMP的EV生产。这一额外的分离步骤能够更有效地去除蛋白质污染物，并能产生与UC类似的EV产量。同样，基于尺寸排阻的EV分离方案也可以很容易地扩大规模。 3.关于样品收集、处理和储存的标准化的建议 鉴于生物流体的复杂性和异质性，通过样品收集、存储和处理的标准化，尽量减少预分离和分析前变量至关重要。这里列出了一些减少下游分离和分析的人为因素影响的建议和措施。 4.样本收集、样本匹配、样本量和数据收集 对于从培养细胞中分离EV，建议如果可能，使用无血清培养基，或无EV血清作为细胞培养基中的生长补充剂。临床血液样本采集，重要的是使用最小化剪切力的针头，减少血小板活化和血小板和红细胞衍生EV的释放，丢弃第一段收集的血液，静脉穿刺引起的细胞碎片也会造成污染。对于每个被收集到的标本，亲本细胞也建议尽可能进行收集，以实现分子匹配、图谱分析、细胞和EV成分的差异分析，并确定与EV源变化相关的特定分子特征，如疾病的阶段。进食/禁食状态和样本采集时间（晨/晚）影响样本中的EV水平，但需要更多的研究来确定最佳参数。当设计发现生物标记物和分析EV成分的实验时，具有至少80%的统计功效的样本量至关重要。最后，应收集有关患者/动物的年龄、性别、种族、疾病状态和治疗状态的信息，以了解这些参数对EV含量分析的影响。 5.样本处理 大多数已发表的从血液中分离EV的研究建议使用血浆进行分离，因为血清中含有血小板来源的EV，这些血小板主要在凝血过程中释放。此外，抗凝血剂(肝素、柠檬酸、EDTA)的选择也会影响研究结果。许多研究表明，使用EDTA作为下游EV-RNA分析的抗凝剂，因为它可以阻止EV-细胞聚集物的形成，抑制血小板来源的释放，并且肝素会抑制PCR反应。通过初步离心分离细胞（红细胞、白细胞(WBCs)、血小板），应以尽量减少细胞成分释放的速度进行。此外，必须采取预防措施，尽量减少加工时间，以避免样品由于温度和酶活性如RNA酶和蛋白酶水解而导致降解。 6.样品稳定性和储存 许多研究已经进行了各种生物液体，如尿液、血液和支气管肺泡灌洗(BAL)评估各种存储温度的影响(4°C?20°C和?80°C)和冻融循环（一到十）的大小，组成，和功能。总的来说，目前的证据表明，?80°C是保存EV含量用于下游分子谱分析的最佳温度。然而，应尽量减少冻融循环，因为EV可能会发生聚集和裂解，导致高估EV大小，低估EV计数，并在分离过程中造成损失。此外，当拟用于药物传递应用的EV经过冻融循环时，载物的损失会导致效力的丧失。 三、EV分离方法 需要高效分离EV或EV亚群，并从污染蛋白和其他可能的基质污染物中分离出来，以确保准确推断EV或感兴趣的特定EV亚群的生物活性和功能。在这里，我们描述了目前和常用的EV分离方法及其优缺点（总结见表1）。 1.UC 目前的“金标准”技术是UC，它根据EV的密度从其他样品成分中分离和浓缩出来。EV的密度通常为1.13-1.19g/ml。这个过程先将所有细胞和细胞碎片分离出来，然后上清液转移到超离心机离心两次100 000xg或更高的速度，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗重悬，减少蛋白质污染。然而，这种方法也可以分离出不同大小和组成的MV和微粒，包括病毒、脂蛋白颗粒和蛋白质复合物。UC的通量也很低，需要昂贵的专业设备，过程中也会破坏EV膜或引起聚集。使用额外的密度梯度步骤，可以进一步提高基于UC的EV分离的纯度。蔗糖梯度和商业化OptiPrep密度梯度是常用的方法。这种方法的一个缺点是，可能需要额外的纯化步骤来将EV亚群彼此分离、从其他密度相似的微粒和密度梯度基质中分离出来。 2.SEC 尺寸排除色谱(SEC)根据水动力体积分离样品的组分。SEC通常使用琼脂糖CL-2B或类似的平稳基相柱进行，其中组分用PBS洗脱。SEC简单稳定、可规模化，不需要昂贵的设备，并且可以在温和的洗脱条件下使用，应用广泛。此外，SEC可能是一种有效的下游蛋白质组学分析的EV分离方法，因为高丰度蛋白还原与UC相当或更好。然而，它受到EV分离的低分辨率和稀释度的限制。有充分的证据表明，在SEC囊泡分离物中存在污染物，包括脂蛋白颗粒、病毒颗粒、游离蛋白质和来自生物基质的蛋白质复合物。然而，基于SEC的分离方法的产量和EV：蛋白比值通常都显著高于基于UC的方法。然而，同样的研究表明，UC分离比SEC分离产出更多较小EV，并含有更少的载脂蛋白(APO)颗粒。此外，SEC固定相可能与分析物表现出非特异性的相互作用（即离子交换相互作用），从而导致分离选择性的变化。 3.过滤法 过滤使用由分子质量和大小定义范围的基质，通常使用纤维素过滤器。在初始过滤后，通常包括额外的超滤和洗涤步骤，以去除小于特定尺寸的污染物，并浓缩囊泡样品。基于离心的过滤器(Centricon)已被证明可以回收的颗粒是压力驱动膜(BioMax)的三倍。聚热砜纳米膜也已成功应用。一个更优化版本-TFF，比传统的过滤更不容易堵塞。与UC相比，过滤技术具有压力温和、省时、纯化效果好和可规模化等优点。此外，分离在很大程度上取决于滤膜的质量和膜孔径分布的均匀性。此外，过滤可能会由于挤压效应而改变EV的结构完整性，并导致EV在过滤膜上损失。因此，该方法对高复杂性和高动态范围的生理液体的适用性可能会受到低回收率和从高丰度污染物中分离效率不足的限制。 4.基于免疫亲和性的分离策略 基于免疫亲和的分离策略使用高度特异性的抗体-抗原相互作用来靶向特定的EV群体，减少受污染的EV和微粒。在许多研究中，已经使用抗体分离出了EV。其中一种方法是，生物素化抗体在链霉亲和素包被的磁珠上捕获，以分离特定的EV亚群。另一种方法使用基于纸的免疫亲和装置，通过将抗体偶联到色谱纸上，然后使用扫描电子显微镜(SEM)或ELISA，针对已知的特定疾病标记物以及肝素的抗体已被用于纯化EV并评估其诊断潜力。免疫亲和分离减少了分离时间，增加了纯化的特异性，但成本昂贵，且经常受到非特异性结合、竞争性抑制和抗体的交叉反应性的困扰。此外，抗体的寿命较短，而且EV从固定阶段的特异性释放可能是不确定的。 5.商业化试剂 最近，已经出现一些商业化试剂盒来分离EV，其产量可与基于UC的技术相当，而不需要任何专用设备。目前已有基于聚合物沉淀的商业EV分离试剂盒，包括ExoQuick?外泌体沉淀溶液（(Systems Bioscience）、miRCURY(Exiqon)和总外泌体分离试剂(TEIR)（Invitrogen）。像PureExo和MagCapture这样的非沉淀试剂盒也是有市售的。另一种试剂盒是Exo-Flow，它使用抗体标记的磁珠来靶向表面蛋白。总的来说，这种试剂盒通常也会导致高水平的蛋白质污染，需要长时间的分离过程，而且可能会很昂贵。此外，这种试剂盒的专有配方可能会干扰下游实验。Exocuick、miRCURY、TEIR和UC的比较研究显示，分离的EV大小分布相似。 6.新兴技术 由于EV的研究是一个相当新的领域，新的EV分离技术正在不断发展。在这里，我们将讨论最近出现的几种方法。 （1）微流体 微流控EV分离技术包括免疫亲和捕获和基于EV的物理或力学特性（尺寸、密度、可压缩性、粘弹性等）的捕获。基于物理性质的方法要么是压力驱动的，要么是电泳驱动的，后者不太容易堵塞孔隙或通道。ExoChip捕获具有抗cd63抗体功能化的聚二甲基硅氧烷表面修饰的EV，然后进行荧光碳氰酸染料染色，以快速定量EV。另一种微流控过滤装置利用多孔聚合物单体作为过滤膜，调整到不同的几何形状和孔径。粘弹性流和声分离系统也是新型无损无标记微流控技术，可能用于EV分离和尺寸分类。这些方法具有样品量低、成本低、消耗量低、高通量、精度高等优点。 （2）不对称流场流分馏法（AF4） AF4是一种温和的分离技术，不需要可能改变、保留和降解EV样品的固定相。分离是在层流的薄膜（亚毫米）中完成的，层流被限制在一个底部有膜的狭窄室中，其中施加一个垂直于层流的力场。与基于色谱的分离方法不同，AF4具有可编程的交叉流强度，可以在分离过程中进行优化，以提高效率。最近的研究表明，AF4结合敏感的分子分析，可以作为一种有效的分离技术，基于特定的EV和颗粒亚群的大小，从而解决生理液体中EV异质性的复杂性。在线探测器，包括紫外、多角度光散射(MALS)和动态光散射(DLS)，被有效地用于AF4，将小EV分离成不同的亚群——小外泌体(Exo-S，60-80nm)、大外泌体(Exo-L，90-120nm)和更小外泌体(~35nm)。 （3）纳米流式检测技术（Nano-FCM） 通过对背景参考噪声的系统分析，开发了一种基于高分辨流式(FCM)的EV分类方法。采用该方法，对来自免疫细胞系和肿瘤细胞系的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯和细胞微量紫染色EV进行了分类，保真度分别为78%和99%，[100]。EV FCM的缺点包括可能同时检测到两个或多个EV，或集群检测，导致信号高估和不适当的测量，特别是在处理亚微米大小的粒子时（这里指的并不是NanoFCM纳米流式，而是Sony的细胞流式）。也有可能引入脂蛋白颗粒污染，以及使用不适当的尺寸标准。 （4）多种技术结合 为了提高EV分离的特异性或纯度，可以结合多种方法。UC之后的密度梯度步骤，SEC或AF4，已经有报道。另一种组合方法是超滤后液相色谱(LC)，已被证明回收率明显高于UC，并能保持其生物物理特性。 四、EV的鉴定：挑战和需求 LDLs的直径与外泌体相似，而HDLs在所有EV的密度范围内都有存在。当使用传统的方案时，EV分离物极有可能含有脂蛋白。消除污染蛋白将通过减少可能的污染物提高表征结果，然而，使情况更具挑战性的是，EV的回收率和蛋白质产量可能较低，并在分离和样品处理的后续步骤中进一步损失。此外，虽然有一些常用的蛋白质标记，但为所有可能的EV类型寻找一个通用的标记Panel或针对特定EV群体的特定标记Panel仍然是该领域的一个重大挑战。设计简单、有效和经济有效的方法来评估EV分离的纯度，将使生物和临床应用成为可能，并将促进EV领域急需的标准化。 五、EV表征方法 1.理化表征方法 在表2和图3中总结了这些方法。 （1）显微镜和成像 利用共聚焦显微镜，EV的释放、摄取和交换可以通过~200nm分辨率的荧光标记细胞膜来监测。另一种方法是将用报告基因标记的EV注射到活标本中，并通过各种方法进行成像，包括MRI、单光子发射计算机断层扫描/正电子发射断层扫描(spect/PET)或荧光介导断层扫描(FMT)。这些成像方法可以用来确定哪些组织和器官的EV被吸收，并可以监测宿主对EV的降解情况。 使用这些方法监测EV的优点是：可以确定它们在宿主体内的位置；EV被细胞产生和吸收时可以观察到；可以在动物研究中获得图像，而不使用侵入性采样技术。然而，它也有一些缺点。一种用于标记EV的常见染料(PKH67)可以比EV更持久或聚集，形成胶束，从而导致假阳性，导致EV总数被高估。其他挑战包括需要高度特异性和稳定性的标签，并通过荧光获得可靠的EV浓度。 透射电子显微镜(TEM)是一种用于识别样品中的粒子的成像方法。EV被固定在样品网格上，并在分析前用醋酸铀酰或四氧化锇等试剂进行染色。电子辐射将分辨率提高到亚纳米的分辨率。2D和3D图像都可以使用各种计算机程序来创建。TEM和冷冻透射电镜（低温条件）也可以用于观察通过细胞出芽的EV的形成，可以比较不同细胞类型或条件之间的EV形成。 冷冻透射电镜的优点包括能够直接观察样品，将损伤降低6倍，在样品制备过程中尽量减少脱水导致的形态变化，并且不需要染色程序。然而，使用TEM/冷冻TEM的缺点包括对将图像转换为3D的计算能力需求高，挑战样品制备和处理方法，由于冰伪影(cryo-TEM)导致的低信噪比，高成本和低通量。同时也很难判断EV是进入细胞还是从细胞出芽（内吞作用和胞吐作用）。由于制备技术，一些较大的EV可能被排除在外。此外，TEM也不是可靠的定量技术。因此，如果需要进行浓缩，还应该使用其他技术。最近，可以自动分析TEM图像的软件(TEM ExosomeAnalyzer)被创建出来，但目前还不能使用冷冻透射电镜图像。这样的软件工具将减少人类主观判断所带来的误差。 除了透射电镜外，原子力显微镜(AFM)也是一种高分辨率的EV成像技术。在一项研究中，AFM被用来表征血小板衍生的EV，这些EV被捕获在CD41抗体修饰的云母表面上。结果显示，CD41阳性EV的数量和尺寸分布结果可重复；更高的分辨率使AFM能够检测到小到几nm的EV，这远比常规的FCM更灵敏。除了提供EV的表面拓扑结构外，AFM还能够提供子结构细节。在一项研究中，在 phase-modulated tapping模式下，成像力从b1 nN到~2 nN，圆形EV在特定阶段在中心凹陷处出现变形。这表明EV的密度和成分不均匀，这与之前在不同EV装载物中的发现一致。与透射电镜一样，有限的通量和专业设备要求是AFM的缺点。 （2）DLS DLS，也被称为光子相关光谱或准弹性光散射，是一种确定悬浮在流体介质中的粒子大小分布的技术。DLS主要测量溶液中大分子结构与溶剂分子碰撞引起的布朗运动速度。通过DLS测量尺寸提供了一种简单而节省时间的技术，它提供了关于粒度大小分布的平均尺寸和分散性的信息，从1nm到6μm的粒子的多分散性指数(PDI)。DLS已被用于一些涉及从血液和BAL等生物液体中分离的EV特性的研究。DLS是单分散样品尺寸测量和监测聚集的理想方法，因为散射强度与d^6成正比，其中d是粒子的直径。在生物流体中，由于存在不同大小的囊泡、颗粒和生物分子，样品是多分散的，其范围从几纳米到几千纳米不等。必须去除大颗粒(＞1μm)，如细胞碎片和死亡细胞，以及聚集的蛋白质和蛋白质复合物。低分辨率是DLS的一个重要限制，只有当粒子的大小差别至少3倍以上（例如，50nm和150nm）的峰值分辨率才是最好的，导致当粒子有一个接近的粒径分布时的结果展宽严重，PDI值更大。 （3）纳米颗粒跟踪分析(NTA) NTA是一种暗场显微镜技术，基于激光散射跟踪的粒子的布朗运动，可以有效地测量液体悬浮液中的颗粒粒径分布和浓度。粒子在激光照明下散射光，它们的布朗运动由配备摄像机的光学显微镜实时成像。通过跟踪单个粒子的均方位移，该软件可以使用斯托克斯-爱因斯坦方程来确定其理论水动力直径。与DLS中光散射和粒径分布偏向于大粒子的情况相比，NTA通过测量光散射强度和单个粒子的大小，为大小不同的非均匀粒子混合物提供了更好的分辨率。此外，NTA可检测用稳定荧光团标记的EV。被分析物的折射率(RI)（例如，胶体金的高RI和细胞来源的囊泡的低RI）决定了NTA可检测到的大小范围。最小的可检测的EV尺寸通常在50nm左右，但信噪比和散射光的量也应该被考虑在内，以提高测量的精度。由于布朗运动很难精确跟踪，其上限约为1μm，EV定量分析的准确性也是一个挑战。 （4）FCM FCM可以用于生物标志物的发现，或通过测量光散射或样品颗粒的荧光来确定EV的大小。样品可以用荧光标记和/或抗体(抗cd63、抗cd81或抗cd9)进行标记，以跟踪EV。样品通过不同波长的多个激光器，即散射光，前向散射(FSC)或荧光的数量和方向，以及持续时间，表示测量的EV的大小，而侧向散射(SSC)表示内部复杂性。SSC比FSC更敏感，更适合用于低浓度样品的分析。也有报道称，使用较低的波长(405nm)提高了所有EV尺寸的SSC灵敏度和分辨率，对较小的EV有更显著的影响。为了提高EV的检测水平，可以将亲脂性荧光团或EV特异性荧光标记抗体结合到EV膜上。对特定靶蛋白的定性和定量分析可以帮助确定哪个EV亚群更普遍，这可能对各种疾病的诊断至关重要。 FCM的优点包括适用于未经处理的生物样品、分析速度快、可重复和定量。然而，大多数流式细胞仪上检测不到200nm以下的粒子。为了降低检测限，纳米流式检测仪（NanoFCM）被开发出来。同样的原理也适用；然而，收集到的光散射的角度也发生了变化，允许探测到40nm的颗粒。如前所述，集群效应也会影响测量值。不幸的是，由于RIs的差异，光散射标准球并不能正确地与EV尺寸相关。由于EV的RI低于聚合物标准球，因此EV的测量尺寸可能是相应尺寸标准的两倍左右。硅球的RI比聚苯乙烯球更类似于EV，因此它们可以作为更好的标准。二氧化硅和聚苯乙烯的标准替代品也被引入用于EV FCM分析。例如，脂质体或中空的有机硅珠散射光类似于EV。此外，来自不同制造商的硬件差异可能会导致差异，在比较来自不同流式细胞仪的数据时应该考虑到这一点。（NanoFCM使用二氧化硅球作为标准品，比普通流式用PS球更接近生物样本的折射率。） （5）电阻脉冲传感器(RPS) RPS是一种基于库尔特效应测量溶液中粒子的大小、浓度和电荷的高通量方法。当粒子通过两侧有电解质溶液的膜中亚微米大小的孔时，测量施加电流的变化。粒子的大小由电流与背景电流的变化之比决定的。干扰的长度与粒子的体积有关，电阻率与浓度有关。通过将电阻颗粒信号与电压和压力联系起来，可以测量zeta电位。在Spectradyne LLC的仪器中，样品通过一个固体孔或孔径，而Izon Science的仪器有一个可调的、可拉伸的孔，可以为特定的实验进行优化。 RPS是一种很有吸引力的EV表征方法，因为它能够同时测量低至40nm颗粒的尺寸、浓度和zeta电位。该技术也可以调整到一个特定的尺寸范围，需要大约40μl的样品。然而，与NTA类似，RPS不能确定样品的颗粒类型或化学组成，这使得很难确定样品是否含有EV、蛋白质聚集物或其他非膜性颗粒（如脂蛋白、碎片）。另一个问题是，RPS和NTA在检测较大(＞150nm)和较小(＜150nm)的EV时，检测结果不一致：RPS可能倾向于更有效地检测较大的粒子，而NTA可能倾向于较小的粒子。挑战在于确定哪种方法更准确，或者这两种方法是否可以串联使用，以获得样品中EV的更准确的表征。聚苯乙烯或二氧化硅球，以及潜在的其他标准，被用来校准RPS仪器，这为初始标准化提供了依据。具有不同表面化学性质或脂质体的珠子被用来校准zeta电位。这种技术需要频繁的校准。在许多研究中，该仪器在每个样品之前进行校准，以确保EV样品的正确测量。 （6）新兴技术 拉曼光谱(RS)是基于非弹性光散射，其中光子能量转移到EV分子或从EV分子转移出来，导致波长从入射光的波长偏移。转移能量的量与散射光子波长的位移成正比，这取决于样品粒子的分子排列。对非弹性散射光子的测量得到了一个光谱指纹，在外观上类似于红外光谱。RS以前已被用于来自哺乳动物细胞系、细菌和人类样本的EV。 该方法通常能够在一次测量中提供关于样品的化学成分或至少是样品的主要成分的一些信息，最少只需要准备50μl样品。虽然RS似乎可识别EV，但由于EV的化学复杂性，获取信息光谱具有挑战性。RS的通量一般，这使得在临床上使用具有挑战性。RS可以用于相对快速的EV测量，而不需要靶向蛋白生物标志物。RS已在工业上用于小分子；然而，也有研究表明，RS也可以用于EV分析。RS被证明有可能识别特定囊泡的来源（如骨髓、脂肪组织、真皮成纤维细胞）的潜力。本研究开发的方法表明，在EV被用于体内或体外临床应用之前，可以进行工业规模的批量鉴定。这种方法可用于增加生物技术和生物制药行业提供的EV产品的数量。 频率锁定光学低语倏逝共振（FLOWER）使用一种防腐涂层硅微环管，其共振频率被激光探测。样品流过微环状光学谐振器，EV与抗体结合。每次分析物结合，共振频率移动和EV浓度计数都可获得。振幅的变化对应于与微环面结合或脱离结合的粒子的直径。这种方法仍然需要进一步的评估，但它有识别EV的潜力。 单粒子干涉反射成像(SP-IRI)，作为ExoView系统出售，是基于固定在传感器表面的粒子（用荧光抗体标记）与从传感器表面反射的光的干扰。干扰可以与大小相关。这项技术主要应用于病毒，但也开始应用于EV。       发自小木虫Android客户端 |
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