外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十二） - 生物科学 - 细胞科学

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今天分享一篇发表在 J Extracell Vesicles（2020年IF=14.98）上的文章，名为《Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications》[1]（建立一种应用于临床的简化的二分尺寸排除色谱法分离细胞外囊泡）。

细胞外囊泡(EVs)是一种具有不同的生物学或病理功能的细胞来源的颗粒。根据EV的生物发生和特征，可大致分为外泌体和微囊泡(MVs)。一般来说，外泌体是直径为30-200nm的EV，随着多泡核内体（MVE)的成熟在细胞内形成。如果不考虑细胞内的起源，与外泌体大小相似的EV可以统称为小EV（sEVs）。MVE膜与细胞质膜融合后，可以释放外泌体。与外泌体不同，MV是较大的EV，典型的直径在500~1000nm之间。MV主要是通过质膜的直接出芽，在细胞外释放而形成的。然而，EV往往有更为复杂的亚群体。例如，Kowal等通过蛋白质组学分析发现从人树突状细胞分离的不同EV亚型有共同的生物标记物如flotillin和热休克70kda蛋白质(HSP70)，同时也有一组五种蛋白质在不同的人群种有不同的相对丰度。所有EV亚群之间的功能差异和特征尚不清楚。但是，人们普遍认为EV在各种人类疾病的诊断、预后和治疗方面具有重要价值，因为它们携带组织和/或器官衍生的生物分子，如蛋白质、RNA、DNA和脂质。

EV生物标志物的研究面临着许多挑战，特别是在将分离和鉴定方法标准化应用于临床方面。此外，样本收集、存储、分析方法和样本量在任何EV生物标志物的验证阶段都具有重要意义。正如MISEV2018和国际细胞外囊泡协会(ISEV)的其他立场文件所说，分离纯化EV是在后续分析之前最重要和最困难的先决条件之一。特别是从复杂体液中分离EV往往处于纯度和易于操作之间的两难境地，这对现实临床应用都至关重要。在30多种生物样本中，血浆/血清是生物标志物发现和疾病诊断中使用最广泛的样本类型之一。然而，血浆/血清中存在多种生物分子或生物纳米颗粒的大小和密度与EV相似，主要包括脂蛋白、亚细胞器、细胞碎片和病毒颗粒。其中，低/极低/高密度脂蛋白(LDL、VLDL、HDL)是EV分离中最常见的污染物之一，因为血浆中有～10^16脂蛋白/ml。MISEV2018建议可以分析几种蛋白质标记物，以证明EV纯度，包括那些能证明EV存在的标志物，以及在共同分离时污染物的消耗。此外，蛋白质单位颗粒比（颗粒/蛋白质比）也是估算EV纯度的一个重要参数。此外，Tian等人报道了另一种间接的方法，通过使用纳米流式检测技术(nFCM)将TritonX-100可破坏的颗粒与总颗粒的比例来估算EV纯度。

目前人们认为，超速离心法(UC)，特别是密度梯度离心法是最被接受的高纯度EV分离方法之一。但UC不能很容易地用于医学实验室，因为它往往耗时，颗粒回收率低，需要大型仪器。在这里，将粒子回收率定义为回收粒子与输入粒子的比值。基于过滤或沉淀的方法可能会遭受严重的蛋白质污染或引入外源性化学物质。相比之下，尺寸排除色谱(SEC)提供了一个重要的选择，不需要大型仪器，同时分离纯度与UC相当。

SEC使用聚合物在柱中形成多孔固定相，允许不同大小的颗粒通过重力流或使用液相色谱系统进行差异洗脱。虽然已知乳糜微粒、LDL和VLDL不能完全去除，但SEC可以有效地将EV从白蛋白等体液中大多数高含量的蛋白质污染中分离出来。

大多数SEC分离EV的研究需要收集大约26个洗脱馏分，部分馏分可合并用于EV分析。事实上，对于临床应用，我们认为使用重力流SEC进行EV分离的简化方案具有显著的需求。为了解决这个问题，需要评估SEC的三个方面。首先，需要充分的解决树脂的选择问题。交联(CL)琼脂糖基材料是EV分离中最常用的SEC树脂之一，然而，这些材料尚未得到充分的比较。其次，应对EV分离时的柱体积进行优化。10ml的柱体积是SEC中最常用的设置，而对于具有相同内径的柱，已有研究表明，增加柱体积可能有更好的分离性能。但是，到目前为止，据我们了解，重力流柱还没有得到验证，至少根据同行评审的出版物。第三，采用上述树脂和柱体积组合，分离方案应尽可能简单，即使是实验室医学培训不足的人员也可以操作。

本研究逐步解决了上述三个问题，如图1所示。比较了所有三种琼脂糖CL树脂，即CL-2B、CL-4B和CL-6B的性能，然后进行了柱体积优化。在这些优化的条件下，我们证明了2个批量洗脱步骤的二分式SEC分离足以从胎牛血清(FBS)、人血清(HS)和无FBS细胞培养上清中分离EV，具有高纯度和颗粒回收率。这种简化的EV分离方法具有潜在的用于临床的优势。

材料和方法：

一、FBS

FBS（批次#：2014014）购自BI，在室温下300×g离心10min，在4?C下17000×g离心20min以清除碎片。上清液用0.22μmMinisart高流量PES注射器过滤器过滤，并在-80?C保存。

二、人血清(HS)

本研究采集的人类血液样本已获得暨南大学第一附属医院伦理委员会的批准。包括4名健康捐赠者（3名女性，1名男性，年龄24-32岁，正常饮食）。供体1的样品用于评价不同树脂和柱体积的性能，以及SEC和UC的蛋白质组学比较。采用供体2-4的血清进行二分法SEC方法的验证。对于每个捐赠者，使用22号针和无添加剂的真空采血管从肘正中静脉或基底静脉抽取外周血。血样在室温下直立1-1.5h，以便凝血。然后按照上面描述的FBS的处理方法处理血样。

三、SEC柱的填充和平衡

SEC柱在使用前一天进行填充。琼脂糖CL-2B、CL-4B或CL-6B树脂通过轻轻翻转2min以上彻底重悬。为了制备柱体积分别为10ml和20ml的SEC柱，分别将13.5ml和27ml树脂分别装入Econo-Pac色谱柱。准备好柱，并在4?C下保持静止过夜，使树脂沉淀并达到每重力指定的柱体积。在EV分离之前，在柱的顶部添加了带有Econo-Pac色谱柱的上层床支撑，以防止其被干扰或干燥。然后在进行样品加载前，用2倍的PBS(0.22μm过滤，以下同)平衡柱。收集从SEC柱中滴出的最后1mlPBS，用于检测背景颗粒和蛋白质。

四、用常规SEC分离EV

HS和FBS样品在室温下解冻，然后在4?C下以17000×g，10min离心，以去除冻融过程中产生的聚集体。然后将上清液装入SEC柱中。将1ml的样品装载在平衡的SEC柱的顶部，以使其通过重力流完全滴出。分馏时，每个馏分加入500μlPBS，并收集洗脱液。前500μlPBS洗脱的洗脱液计算为分数1。10ml和20ml柱分别收集26和52个馏分。所有馏分均存储在-80?C下，用于下游分析。

五、二分式SEC分离EV

在样品（1ml）完全滴出柱之后，立即用不同组合的PBS进行2次洗脱（7.5ml和18.5ml，8ml和818ml，8.5ml和17.5ml，9ml和17ml，或9.5ml和16.5ml）。样品流和第一次批量洗脱的洗脱液作为洗脱液1。然后收集第二次批量洗脱液作为洗脱液2。洗脱液1和2分别使用具有30kDa分子量切断(MWCO)膜的过滤器Amicon Ultra-4过滤器，通过5000×g和35?固定角转子离心浓缩。

六、SEC柱的清洗和恢复

为了评估重复使用的柱的性能，我们按照GE医疗公司提供的琼脂糖树脂进行了柱清洗和恢复。使用的SEC柱用2×柱体积的清洗液清洗，然后用2×柱体积的PBS洗涤进行恢复。下次使用时，应用1×柱体积的PBS重新平衡。

七、纳米颗粒跟踪分析(NTA)

颗粒大小和浓度由NanoSight NS300分析仪确定，配备488nm蓝色激光和sCMOS相机。样品用PBS稀释≥20倍，然后装入仪器。对每个样本，采集3个随机视角的视频，仪器参数设置如下：温度控制器，on；温度，25?C；摄像机水平，14；捕获持续时间，60s。视频采用以下参数进行分析：粘度、水（0.89cP）；检测阈值，3。使用NanoSight NTA3.4软件(Malvern)报告了从3个视频中计算出的粒径和平均浓度。

八、透射电子显微镜(TEM)

用等体积的4%的多聚甲醛固定从供体3的HS(w/v)中分离出的洗脱液1的20μl。10μl的固定样品被一个formvar碳涂层的TEM网格吸收，然后再用1%（w/v）戊二醛固定。栅格用醛酸铀酰溶液(4%醋酸铀酰，0.0075M草酸，pH7)染色，并在甲基纤维素-ua（0.4%醋酸铀酰，1.8%甲基纤维素）中干燥。最后，用TecnaiG2透射电子显微镜在100kV下观察网格。

九、蛋白[质]印迹法

通过BCA蛋白测定法(Thermo)测定蛋白浓度。对于从常规SEC样本中获得的多个馏分的IB，采用两种样本加载策略。对于含有足够蛋白质的组分，装载20μg蛋白。对于每32μl蛋白小于20μg的组分，使用32μl的样品。所有样品分别用PBS调整到体积为32μl，然后加入8μl的5×上样缓冲液。煮沸10min后，将样品装入NuPAGE10%Bis-Tris凝胶(1.5mm×15孔，Thermo)中。在1×NuPAGEMOPSSDS运行缓冲液(Thermo)中，在200V下进行35min的电泳，然后在1×NuPAGE转移缓冲液(Thermo)中，以20V常数下进行PVDF膜(Thermo)转移1小时。用5%的牛奶和含0.2%Tween的Tris缓冲盐水(TBST)封闭膜，并与一抗在4?C下孵育过夜。一抗包括rabbit anti-apolipoprotein A-I/ApoA1 pAb、rabbit anti-integrin β3 mAb、rabbit anti-syntenin mAb、rabbit anti-TSG101 mAb、 rabbit anti-CD9 mAb、rabbit anti-CD63 mAb、rabbit anti-albumin mAb、 mouse anti-ApoB mAb。二抗染色时，用TBST洗涤膜3次(每次5min)，并与二抗在室温下孵育1h。HRP偶联的二抗包括抗兔IgG和抗小鼠IgG。最后，在用Clarity Western ECL Substrate孵育之前，用TBST洗涤膜3次(每次5min)。图像拍摄是使用590nm滤光片的5200 Multi imager。

对于二分式SEC中洗脱1和洗脱2上的IB，考虑到目标蛋白的丰度，分别装载5、10、20或30μg蛋白/通道。采用考马斯亮蓝R-250染色分析，验证根据BCA结果计算出的相同量蛋白的负载。

十、SW620细胞培养上清液的二分式SEC实验

SW620细胞在cDMEM培养基中培养，包含10%胎牛血清、1mM丙酮酸钠、1%青霉素/链霉素和10μg/ml环丙沙星。为了制备用于EV分析的上清液，将SW620细胞接种于1.5×10^7个细胞/烧瓶中，培养48h。用PBS在瓶中洗涤2次，用DMEM冲洗，然后在10mlDMEM中培养24h，让EV分泌。然后收集上清，用GL-21M离心机在220×g10min和15000×g离心30min，分别去除细胞和碎片。用0.22μm过滤器过滤后，使用30kDa MWCO超滤(UF)装置将上清液浓缩至～1ml。制备21个含～210ml上清液的烧瓶，用于EV实验，包括颗粒和蛋白浓度、IB和EV纯度的测定。

十一、SW620细胞的荧光标记

在荧光标记实验中，8个75cm2烧瓶的贴壁细胞用PBS洗涤两次。最后在PBS中加入浓度为5μM5（6）-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)，每1×10^7细胞/1ml。对于未标记的组（8个烧瓶），使用PBS模拟CFDA-SE标记。然后将烧瓶在37?C下孵育10min。然后加入5×体积的cDMEM终止染色。用PBS在瓶中洗涤2次，用DMEM冲洗，然后在10mlDMEM中培养24h，使EV分泌。然后用上述相同的程序制备用于EV分析的上清液。

十二、nFCM分析

采用nFCM(NanoFCM)分析，评估颗粒大小、荧光强度和EV纯度。由于EV将被TritonX-100裂解，EV纯度可以通过TritonX-100破坏粒子占总粒子的比例间接反映。采用含有68nm、91nm、113nm和155nm二氧化硅球的混合物（S16M-Exo，NanoFCM）作为粒径标准品。将SW620 EV与TritonX-100混合，最终浓度为1%(v/v)，并在冰上放置1h。然后将稀释后的样品与等量的1%(v/v)FITC标记的作为计数标准的250nm二氧化硅纳米球混合。nFCM分析的仪器参数设置如下：激光，10mW，488nm；SS衰减，10%；采样压力，0.8kPa；采样周期，100μs；记录时间，1min。

十三、荧光测量

对CFDA-SE标记和未标记的SW620细胞的培养上清液进行二分式SEC检测。洗脱液1和洗脱液2分别通过UF浓缩至100μl。将70μl的浓缩洗脱液1或洗脱液2装入96孔板中。荧光强度(FI)使用Victor X5 multilabel plate reader(PerkinElmer)进行测量。样品用488nm激光激发，发射光通过535/25nm带通滤光片记录。

十四、EV的蛋白质组学分析

无血小板血浆（PFP）、超速离心沉淀(UF)、蛋白质提取物、蛋白消化、数据独立采集质谱法(DIA-MS)、数据库搜索和蛋白质定量，内容略。

十五、基因本体分析

十六、数据分析和统计

结果就展示这么多，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Guo, J; Wu, C; Lin, X; et al.Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.[J].J Extracell Vesicles.2021,10(11):e12145