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RNA sequencing
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转录组是指某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA的总和,包括mRNA和非编码RNA(Non-coding RNA)。目前研究较多的非编码RNA又包括:circRNA,miRNAs,及lncRNAs等。基于高通量测序平台的转录组测序技术能够全面获得物种特定组织或器官的转录本信息,从而进行基因表达水平研究、新转录本发现研究、转录本结构变异研究等。 全转录组测序服务主要针对circRNA、lncRNA和mRNA,一举三得,一次测序可以同时得到三者分子的表达情况,可应用于新circRNA和lncRNA预测以及已知circRNA和lncRNA表达水平研究等。 技术路线 • Total RNA提取:根据不同的样品类型采用不同的提取方案,获得高质量的Total RNA。 • RNA质量检测:Nanodrop检测RNA样品浓度及纯度;琼脂糖凝胶电泳及Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA样品完整性。 • rRNA去除:针对不同物种选择合适的rRNA去除试剂盒去除样品中的rRNA。 • RNA片段化:采用mg2+离子打断的方法,将RNA片段化至200-300bp。 • cDNA合成:随机引物反转录合成cDNA第一链;在合成cDNA第二链时掺入dUTP标记第二链,保留了RNA的链方向性。 • 加A尾,接头连接:cDNA两端引入接头序列及标记样品的index序列。 • PCR富集  CR富集文库片段,文库大小为300-400bp。• 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布,Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。 • 上机测序:根据数据量要求将文库pooling上机测序。 • 数据分析:下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析,提供全面数据分析报告。 样品要求 • 样品类型:细胞、新鲜组织或RNA样品。 • 样品量:细胞样品请提供至少1×106个细胞,组织样品请提供至少100 mg的组织块或切片,RNA样品请提供5 μg以上的总RNA。 • 样品质量:RNA无明显降解,提取的总RNA,OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度≥500 ng/μL,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 7。 • 样品保存: 细胞样品:收集细胞至RNase Free 1.5 mL EP管,弃去培养基,用PBS洗一次,弃去PBS,把细胞沉淀保存在-80℃。 组织样品:组织样品离体后放在冻存管中,迅速置于液氮下速冻1分钟以上,然后保存在-80℃。 RNA样品:可将RNA溶于RNase Free 的超纯水中,-80℃保存。 样品保存期间避免反复冻融。 • 样品运输:样品置于1.5 mL管中,封口膜封好,干冰运输。 测序方案 测序模式 PE150 测序数据量 10Gb clean data 生物信息分析内容 • 基础分析: 1 原始数据质控检查 2 比对结果质控检查 3 基于基因表达的样品主成分分析 4 差异基因表达及相关通路富集分析 5 circRNA预测及鉴定 6 circRNA差异分析 7 差异circRNA宿主基因的通路富集分析 8 差异circRNA的靶向miRNA预测分析 9 长链非编码RNA差异分析 • 高级分析: 1 基于基因表达的通路活性分析 2 转录调控活性分析及通路互作分析 3 差异长链非编码RNA的调控基因的通路富集分析 4 circRNA及靶向miRNA网络调控制图 |
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