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NanoFCMlxq

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外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十一）
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今天分享一篇发表在 J Extracell Vesicles（2020年IF=14.98）上的文章，名为《Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution》[1]（在单囊泡和单分子水平定量评估装载入工程化细胞外囊泡的蛋白含量）。

细胞外囊泡(EVs)是一种几乎所有细胞都会分泌的纳米颗粒，分泌到细胞外或体液中，通过功能性生物分子的转移传递细胞间通信。EV已被探索用于治疗人类疾病的药物分子的天然传递载体。事实上，EV作为细胞内传递各种治疗药物的新候选药物已经显示出了巨大的潜力，包括合成的小分子和生物分子，如RNA和大蛋白质。此外，与合成递送系统相比，这些囊泡有几个优点：体积小、免疫原性低、缺乏细胞毒性、长期安全性和易于通过多种策略装载药物。

可以用感兴趣的分子工程化EV来修饰其装载物组成。其中EV的蛋白修饰通常是通过细胞工程实现的，使用编码和过表达目标蛋白的质粒，这个目的蛋白是融合了腔内或膜上参与EV自然发生发展的蛋白。为达到此目的选择的EV蛋白通常在EV制剂中富集，有可能促进装载物高效率装载进入囊泡，在这里被称为EV分选蛋白。常用的EV分选蛋白包括四酯蛋白（特别是CD63、CD9和CD81)、lamp2b和乳酸酯蛋白的C1C2结构域。将所选择的装载物蛋白与EV分选蛋白融合是通过亲代细胞工程将装载物蛋白装载到EV中最常见的策略。这种方法既允许在腔内储存定向输送到靶细胞的装载物，也可以在EV表面展示装载物，通过与靶细胞表面受体的直接相互作用，增强其治疗信号特性或靶向能力。据报道，已成功装入EV的蛋白包括用于体外和体内EV追踪的荧光素酶和荧光蛋白、EV靶向的抗体和多肽、活性酶、用于同时装载RNA的RNA结合蛋白和疫苗免疫原等。有趣的是，许多这些研究表明，装载EV的蛋白的富集水平依赖于所使用的EV分选蛋白。然而，对不同EV分选蛋白的装载效率的综合比较仍仅限于少数候选蛋白，目前缺乏定量分析的工具。

细胞中有多种生物发生途径导致EV的释放，这解释了细胞条件培养基中存在不同成分的囊泡群。即使用目前最专精的方法分离的原代或工程化EV仍具有异质性，并包含具有不同组成的囊泡亚群。对EV的评估主要局限于大量蛋白质含量分析的方法，如免疫印迹、酶联免疫吸附试验(ELISA)、EV结合珠子的常规流式细胞术和质谱，这些方法都不适合单囊泡表征。最近有几种单囊泡分析的技术，可以更准确地评估蛋白装载物，其中一些方法还达到单分子水平。其中包括透射电子显微镜(TEM)结合免疫金标记、原子力显微镜、超分辨率荧光显微镜、荧光相关光谱、纳米流式检测仪（NanoFCM）、成像流式细胞术、单粒子干涉反射率成像传感（SP-IRIS）和激光镊子拉曼光谱。重要的是，这些方法揭示了装载物在原代和工程化EV亚群中的异质分布，突出了在EV标准特征中对高分辨率技术的要求。

本研究旨在探索和验证在单囊泡和单分子水平上分析工程EV的技术，以快速和稳定地评价不同EV分选蛋白在促进蛋白装载物方面的效率。Expi293F细胞被设计成分泌含有绿色荧光蛋白(GFP)的EV，该GFP与在EV中高度富集的选定的膜相关蛋白融合。使用免疫印迹技术（WB）批量分析小EV中的GFP水平，并与新型高分辨率单囊泡分析方法纳米流式（NanoFCM）、ExoView和单分子定位显微镜(SMLM)进行比较。我们的研究结果验证了使用NanoFCM N30设备和ExoView作为快速和可靠的工程EV单囊泡分析技术，捕获了在EV亚群中的异质性GFP分布。SMLM被证实是最准确的方法，可以定量分析单个EV中装载的GFP拷贝数。GFP富集水平的比较分析融合不同EV分类蛋白也显示了新的适合将蛋白装载物高效装载进入EV的候选蛋白，进一步扩大EV分类蛋白的范围，可用于生成增强靶向目标细胞能力和输送功能化治疗药物的工程化EV。

研究过程：

一、EV分选蛋白的选择和生物信息学特征

Vesiclepedia数据库(Home - Extracellular vesicles database)、 ExoCarta(https://exocarta.org)和EVpedia(https://evpedia.info)查询人类EV蛋白，并进一步选择小于50kDa的蛋白质对应的条目。通过文献检索，我们选择了能够耐受融合且不对EV生物发生产生负面影响的蛋白。EV蛋白和GFP序列从UniProt（条目ID：CD47：Q08722；SDCBP：O00560、APMAP：Q9HDC9、TSPAN14：Q8NG11、CD63：P08962、CD81：P60033、PDGFRβ：P09619；GFP：C5MKY7，携带V2A、F65L、S66L和H232L增强荧光），生成融合蛋白（蛋白序列见表S1）。融合蛋白的膜拓扑结构由UniProt注释和之前发表的关于EV分类蛋白的文献来推测。

二、设计质粒

利用人种蛋白表达的密码子优化，将GFP融合域和GFP融合蛋白序列反向翻译成DNA序列。合成DNA插入物并克隆到pEBNAZ表达载体中的SacII和NotI位点，在CMV启动子控制下进行重组蛋白表达。所有的构建物均通过GenScript进行采购。

三、细胞培养

Expi293F悬浮细胞来源于293F人胚胎肾细胞，购自ThermoFisher。细胞以0.5-1×10^6个细胞/ml的密度接种，在化学限定、无血清、无蛋白的Expi293表达培养基中培养至3-4×10^6个细胞/ml的密度，37?C，8%CO2(150rpm)。使用CedexHiRes分析仪（Roche）计数细胞和测量细胞活力。细胞一直使用到第21代。所有细胞均为支原体阴性，并经短串联重复序列DNA谱分析鉴定。

四、细胞转染进行EV生产

将Expi293F细胞以3.9×10^6个细胞/ml的密度接种于45ml的Expi293表达培养基中，置于500ml的康宁锥形细胞培养瓶中。将质粒DNA(75μg)在Expi293表达培养基中稀释，并与40kDa盐酸线性聚乙烯亚胺120μg/ml（(Polysciences）以1：1(v/v)的比例在Expi293表达培养基中混合。该混合物在室温(RT)孵育15min，然后轻轻加入细胞。在相同条件下用无DNA的聚乙烯亚胺复合物处理的细胞作为未转染的对照。24h后，在每个细胞培养瓶中加入50ml新鲜培养基。细胞维持在37?C，8%CO2，150rpm。

五、细胞成像和流式细胞术分析

转染48小时后，对照和转染的Expi293F细胞用4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲盐水(PBS)(VWR)固定，细胞核用Hoechst33342染色（ThermoFisher)。然后将细胞在PBS中重悬，转移到96孔的细胞载体超板(PerkinElmer)中，短暂旋转将细胞沉积到底部，并立即在旋转圆盘共聚焦CV7000显微镜（Yokogawa）中使用40倍物镜(NA0.75)和激光405nm(BP447/45nm)和488nm(BP522/35nm)进行成像。每孔有6个视野成像，记录每个位置。使用ImageJ1.52p软件对图像进行处理。使用配备BDFACSDiva软件(BD Biosciences)流式细胞仪进行流式细胞分析，在门中获得10000个events。数据采用FlowJo v10.7.1软件进行分析。以非转染对照细胞的GFP背景荧光水平作为定义GFP+细胞群体的阈值。

六、EV分离

细胞转染48h后，将细胞培养上清液以300xg离心10min去除细胞，将澄清的上清液转入新管中，2500xg离心30min，4?C，清除残留的细胞碎片和凋亡小体。然后，将上清液转移到94ml快速密封超离心管（Beckman Coulter）中，以20000xg离心25min，4?C，去除大EV。在OptimaXPN-80超离心机中使用了一个45Ti转子（Beckman Coulter）。然后将上清液转移到新的试管中，使用相同的转子(k因子=210.4)在100000xg超离心2小时。用PBS再悬浮洗涤，再重复一次操作。EV在100-200μlPBS中重悬，并在?80?C下冷冻，以待下一步操作。

七、EV的透射电镜观察

EV悬浮液在2%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)PBS中固定30min。使用Bal-TecMED020涂层系统，碳涂层100网铜网格在7.2V下发光放电60秒，EV样品立即在网格上孵育15min，4?C。然后用PBS洗涤网格，用1%戊二醛(Sigma-Aldrich)在4?C下固定5min，再次洗涤，用滤纸吸干。吸附在网格上的EV用2%醋酸铀酰水溶液（Sigma-Aldrich）负染2min，然后使用FEITecnaiG2Spigirt号透射电子显微镜（ThermoFisher）清洗、干燥和分析。

八、EV的纳米颗粒跟踪分析

使用配备蓝色激光(488nm，70mW)和CMOS相机(MM14c)的NanoSight LM14c分析尺寸分布和颗粒浓度。样品用PBS稀释从1000到8000倍，在所有条件下测量20-100个粒子/帧，以100 a.u. 的速度注射到测量室，每次测90s。数据采集的设备设置在测量之间保持不变，相机水平设置为15，自动设置关闭，屏幕增益设置为1，阈值设置为7。数据分析采用NTA 3.2软件(Malvern)进行。

九、EV和细胞裂解物的蛋白印迹分析

转染后48小时收集细胞，用PBS洗涤，用PierceRIPA缓冲液，添加无EDTA蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma-Aldrich)冰上裂解30min。裂解液在4?C下14000rpm离心10min，上清在?20?C下保存。用Qubit蛋白检测试剂盒定量EV悬液和细胞裂解物的蛋白浓度。（省略步骤，常规WB操作）

十、EV免疫标记及纳米流式分析

EV(5×10^11颗粒/ml)用CellTrace远红染料5μM标记15min。然后，用装有TLA-55转子的台式超离心机，用PBS超离心洗涤，去除多余的染料。

EV在纳米流式N30仪器(NanoFCM)上进行分析。EV样品在分析前用PBS稀释，以便在分析期间记录2000-12000个颗粒数据。粒子信号采集采用10mW的蓝色激光488nm/20mW红色激光638nm，10%SS衰减，用1.0kPa的采样压力。采用单光子计数APD探测器的光散射和荧光采集方法，分别为侧散射(SSC)FF01-488/24（触发通道）、524/20和670/30带通滤波片。以HPLC级水作为鞘液，将样品流聚焦至～1.4μm。使用已知浓度的250nm二氧化硅纳米球(用于EV浓度计算)，以及NanoFCM生产的含有68、91、113和155nm(用于EV尺寸计算)的纳米球进行校准测量。PBS用于定义阈值。数据通过NanoFCM专业软件v1.8软件生成。使用PBS对所有数据进行背景校正，以未转染Expi293F细胞的EV作为荧光阴性对照。

十一、用ExoView分析EV

将EV在溶液A(含有Tween-20的专有配方)中稀释，将35μl样品在ExoView四酯蛋白芯片(EV-TC-TTS-01)上RT孵育16小时，放置在密封的24孔板中。该芯片包被了cd63、cd81或cd9抗体，用于EV群体表征，或小鼠IgG1κ匹配同型抗体，用作非特异性EV结合的对照。然后在1ml溶液A中洗涤3次，3min，轻轻摇晃，然后用ExoView四酯酶标记抗体混合(EV-TC-AB-01)在RT下孵育1小时，含有CF647偶联抗cd63、抗cd81和抗cd9抗体和CF555偶联抗GFP抗体，全部在BSA2%的A溶液中稀释1：5000。然后在溶液A中清洗一次，在溶液B中清洗三次，然后用过滤过的去离子水冲洗并干燥。溶液A和溶液B提供了ExoView四酯蛋白芯片试剂盒(EV-TC-TTS-01)。然后，使用ExoScan2.5.5采集软件，使用ExoViewR100对芯片进行成像。使用ExoViewer2.5.0软件对获得的图像进行分析，EV尺寸阈值设置为50-200nm直径。

十二、用单分子定位显微镜分析EV

转染细胞和对照细胞的EV在PBS中连续稀释，并调整到相同的最终颗粒计数（1.6×10^8颗粒），通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)确定，然后沉积在显微镜兼容的384孔玻璃板(Cellvis)上。样品使用安装在Ti Eclipse倒置显微镜（尼康）上的60倍油浸物镜(NA=1.49)进行多次稀释成像。使用相同的光照(100ms曝光时间)和聚焦（通过完美聚焦系统），每个样本获得多个图像(200×200μm2)。为了提高信噪比，图像使用连续四帧进行平均。分析图像的EV密度为<1EV/10μm2，以避免粒子重叠，并在图像中心裁剪65×65μm2区域，以减少小晕和不均匀光照的影响。EV被检测为与显微镜的点扩散功能对应的显微镜的衍射限制物体，证实了单个囊泡的检测。使用阈值图像（>2倍背景强度）对峰值强度(ImageJ)进行粒子识别和量化。去除面积低于0.1μm2和面积高于10μm2的检测斑点，以过滤掉噪声和较大的聚集体。以未转染的Expi293F细胞的EV样本作为GFP荧光背景的阴性对照。

单分子GFP拷贝数的测定采用重组GFP作为参考荧光团。将rGFP以10倍的稀释度(从1nM开始)添加到空孔中，并使用上述相同的设置对多次稀释度进行成像。利用阈值图像（>2倍背景强度）对单个荧光团的ImageJ1.52p进行识别和定量的峰值强度。随后对单个荧光团进行时间分辨成像，通过记录漂白痕迹来确认来自单个荧光团的信号。任何显示出多步漂白痕迹的物体都被从分析中删除。所得到的强度直方图被用于估计单个荧光团的平均信号。同样，用EV的强度直方图来估计平均信号，通过直接除以荧光团的强度，可以估计出蛋白质的绝对拷贝数。由于与重组GFP样品相比，EV样品具有较高的异质性和低纯度，在这次研究中三个GFP分子严格定义为SMLM的检测限，以提供更稳定的分析。

结果展示：

一、EV的分泌受到过表达特定的EV分选蛋白的影响
二、GFP载入EV的效率取决于EV的分选蛋白
三、单囊泡分析揭示了EV的异质性和将GFP装载物纳入工程化EV的不同亚群
四、在单分子水平上的单囊泡分析显示，EV分选蛋白在促进GFP装载到EV中的效率存在差异
结果就展示这么多，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，或者私聊我要文献资料，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Silva, AM; Lázaro-Ibá?ez, E; Gunnarsson, A; et al.Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution.[J].J Extracell Vesicles.2021,10(10):e12130

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