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RRBS甲基化测序 已有1人参与
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DNA甲基化研究一直是疾病研究的热点,与基因表达、表型性状息息相关。是基因调控的手段之一,通过对位于启动子及第一外显子区的CpG岛的甲基化而抑制基因的表达。在维持细胞正常功能、传递基因组印记,胚胎发育、肿瘤发生等方面起着至关重要的作用。 RRBS(Reduced Representation Bisulfite Sequencing)是一种准确且高性价比的DNA甲基化研究方法,在大规模临床样本的研究中有着广泛的应用。RRBS通过限制性内切酶对基因组进行酶切,富集启动子及CpG岛区域,再进行Bisulfite转化,用较小的数据量得到包含最多CpG位点甲基化信息的单碱基精度的甲基化图谱。 • 基因组DNA提取:根据不同的样品类型采用不同的提取方案,获取高质量的基因组DNA。 • DNA质量检测:Qubit检测DNA样品浓度,琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品完整性。 • MspⅠ酶切:通过酶切富集CpG片段。 • 末端修复,加A,甲基化接头连接:在DNA分子两端引入接头序列及index序列。 • 选择CpG富集的DNA片段 • Bisulfite转化:通过Bisulfite作用将非甲基化碱基C转化成U。 • PCR富集  CR扩增富集文库片段。• 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布,Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。 • 上机测序:根据数据量要求将文库pooling上机测序。 • 数据分析:下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析,提供全面数据分析报告。 样品要求 • 样品类型:细胞、新鲜组织或DNA样品。 • 样品量:细胞样品请提供至少5×106个细胞,组织样品请提供至少2-3 g的组织块或切片,DNA样品请提供6 μg以上的总DNA。 • 样品质量  NA无明显降解,无蛋白污染,OD260/280值≥1.5,OD260/230值≥1.0,浓度≥50 ng/μL,• 样品保存: 细胞样品:收集细胞至RNase Free 1.5 mL EP管,弃去培养基,用PBS洗一次,弃去PBS,把细胞沉淀保存在-80℃。 组织样品:组织样品离体后放在冻存管中,迅速置于液氮下速冻1分钟以上,然后保存在-80℃。 DNA样品:可将DNA溶于Nuclease Free 的超纯水中,-20℃保存。 样品保存期间避免反复冻融。 • 样品运输:样品置于1.5 mL管中,封口膜封好,冷冻运输。 测序方案 测序模式 PE150 测序数据量 7.5Gb clean data 生物信息分析内容 1 原始数据质控检查; 2 甲基化序列比对结果分析; 3 测序深度及覆盖度统计; 4 计算C碱基的甲基化水平; 5 DNA甲基化信号在基因组的分布; 6 DNA甲基化信号的基因组元件注释; 7 DNA甲基化图谱绘制; 8 差异甲基化区域分析; |
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