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【实验方法】如何检测细胞污染
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细胞培养技术在生物研究领域内是必不可少的核心环节，在培养过程中面临的一个严重问题就是细胞污染，其中支原体是最主要的污染源。支原体在光学显微镜下不可见，而且被支原体污染的细胞培养基在一般情况下往往并不浑浊，细胞受损程度也不明显，形态很少改变，因此细胞被支原体污染后很难察觉。细胞一旦被支原体污染后，支原体会消耗细胞培养基中的营养物质，代谢产物不断积累，会导致细胞培养环境中pH值的改变，诱导或抑制某些细胞因子的表达，会影响培养细胞的代谢和增殖特征。 在日常工作环境中，支原体可以说无处不在，它可以通过人的毛发、口腔、穿着的衣服、动物的皮毛以及日常的细胞培养的操作环境造成对细胞的污染。能够造成细胞污染的支原体种类有很多，有些细胞甚至同时感染2种以上的支原体。由于支原体体积很小，直径约在0.2-2.0pm之间，可以通过滤膜而直接造成培养基或血清的污染。从形态结构上，支原体形态多变，多吸附在细胞表面或分散于细胞与细胞之间，是一类没有细胞壁的微生物，因此对作用于细胞壁类的抗生素（如青霉素）不敏感。 常用的检测方法有培养法、荧光染色法、PCR法和电镜观察法。 培养法 培养法是最为可靠且成本低廉的方法，但培养周期较长，常用于细胞以及临床治疗细胞的支原体检査； 荧光染色法 荧光染色法是用特异荧光染料（Hoechst 33258）染色后在荧光显微镜下进行检测，荧光染料(Hoechst 33258)是一种能和DNA特异结合物质，如果检测样品为支原体污染，则附在细胞表面和分散在细胞与细胞之间的支原体DNA着色，在荧光显微镜下可见； PCR法和电镜观察法 PCR法检测是通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结果，反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果；电镜观察法是利用电子显微镜的超级放大功能，直接观察培养细胞中支原体污染情况。 下面为您介绍利用荧光染色法来检测培养细胞中的支原体。 荧光染色法检测步骤 （1）细胞爬片培养：待测细胞培养至传代水平，将细胞消化后接种至含有玻片的细胞板中，培养至60%-70%汇合时，进行检测； （2）漂洗：将细胞板中的培养液吸出，取出玻片，用PBS轻轻漂洗； （3）固定：加入适量的固定液，室温放置10min； （4）漂洗：用PBS轻轻漂洗3次； （5）染色：加入适量的荧光染料（Hoechst 33258）工作液，在室温下放置10min； （6）漂洗：用PBS轻轻漂洗3次； （7）镜下观察：将玻片晾干后，滴加抗荧光猝灭剂，于荧光显微镜下观察、拍照； 可见细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点，其形状各异，与细胞共同被染成不规则的点状物，说明细胞被支原体污染。 |
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