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z1358382

木虫 (正式写手)

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[求助] 求解答如何利用Caco-2 细胞成功构建transwell小室转运模型

请问有没有大佬利用transwell 小室和Caco-2 细胞构建吸收转运模型，并成功过，我一直构建失败，寻求解答
1.培养耗材：
①我利用康宁3401和3417这些PC和PET膜来构建，这些显微镜可视和不可视的都尝试过，
②培养基：细胞培养和传代，日常培养基采用10%FBS，1%双抗的MEM，（MEM本身含有100mg/L D-葡萄糖，2200mg/L NaHCO3,292 mg/L L-谷氨酰胺，Earle's平衡盐以及NEAA）商家的细胞就是采用MEM培养
2.构建
细胞生长到80%以上，进行消化，先用500微升含EDTA的胰酶预消化10秒，吸掉，去除贴壁不牢以及细胞团，再加胰酶消化三分钟，然后就是正常传代，电脑细胞计数，稀释
①12孔板的小室（面积1.12cm2的），上室/下室体积添加为，500μL/1.5mL,文献也是这样的，我选择了接种密度是12孔的2.5×10五次方个/mL，后面也试过1.2×10五次方个/mL，（2.5×10五次方个/mL和英文文献的2×10五次方个/cm2进行换算，细胞数目差不多，但是失败了，所以后面选择1.2×10五次方个/mL，还是失败了）然后上室加500μL悬液，根据有个文献标准方法构建，我上午接种完，6小时左右后弃掉了培养基，更换新的培养基，文献说这样是避免长多层，因为是构建单层细胞模型，然后就是隔天换液，到14天后，本应该天天换液，但是细胞出现脱落，试验算是失败，无法进行，就没有更换舍弃了
②24孔板的（0.33cm2），上室/下室100μL/600μL，2×10五次方个/mL或者1×10五次方个/mL，接种上室100μL/200μL,两种密度和加样体积都进行了尝试，因为有文献体积是200μL/600μL（细胞数目换算也和英文8×10四次方个/cm2差不多），也是如上6小时后换液去除没有贴壁的细胞，然后后面都是隔天换液，这个也依然脱落
培养基使用的和日常培养的一样，采用10%FBS，1%双抗的MEM，（MEM本身含有100mg/L D-葡萄糖，2200mg/L NaHCO3,292 mg/L L-谷氨酰胺，Earle's平衡盐以及NEAA）
③根据文献，我后面更改了培养基将血清减半，前三天采用10%FBS进行细胞数目正常生长增殖，后面都是采用5%FBS，就是考虑到是不是营养太多以及细胞数目接种太多才脱落，才密度和血清都减半了
3.检测TEER值，有时候上不去，也不知道为什么。还有就是有时候培养7-10天，电阻值就达到了300-400Ω，但是培养时间没有标准文献里的21天，不知道是否能进行实验
主要问题：1.构建过程中培养基，要不要更换成分，我的培养基除了后面试验血清减半过，其他都如上所述，都是用的一样的培养基
2.细胞密度也没有问题。我正常前一周都贴壁生长，然后后面陆续开始脱落，不知道是培养基还是密度问题，细胞数目，血清浓度我都减半过
3.从细胞生长消化接种到后面的培养方法过程是否有问题
4.电阻值检测：①电阻值上升缓慢的原因，②没有达21天，已经达到电阻值要求能否转运吸收实验
想咨询到底是哪里的问题，求解答