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Dusk_star新虫 (初入文坛)
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[求助]定点突变pcr产物，转化后提不出质粒
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最近在做定点突变，设计上下游引物30bp左右，突变位点在中间，目的基因3300bp，加质粒总长9000bp左右。 PCR之后用DpnⅠ消除模板，转化JM109或BL21，然后挑菌送测序。最近总出现挑到的菌提质粒浓度很低是（三四十左右），送不了测序的那种，偶尔提出质粒浓度正常的还是模板情况。 而且我发现这种提不出质粒的情况不管IM109还是BL21都会出现，在提质粒过程中，加完P3 buffer混匀后，虽然有絮状沉淀但是液体浑浊（正常加完P3后，出现絮状沉淀，液体澄清透亮）。 之前也做了一批突变，还算正常。最近做的时候就总出现，想不到哪里出了问题。 |
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tmoonday
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2楼2021-12-09 22:40:23
小汰宝
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1. 像楼上所说，用DH5α试试。JM109不了解，但是做突变转BL21的话效率很低 2. 环P质粒9000bp成功率也比较低。这么长质粒上的定点突变我一般只p个小几百bp的片段做突变，同时p剩下的载体部分最后做同源重组。麻烦是麻烦一些，但是成功率非常高 3. 你对9000bp质粒环p后看过胶图吗？目标条带应该不浓吧？你非要大质粒环p的话可以加甘油/dmso试下 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2022-03-03 19:24:22
L_大松子
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4楼2022-08-12 00:33:47
