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聊聊｜关于RAPID技术中引物探针的设计和那些BUG
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上一期我们介绍了什么是RAPID，RAPID的原理、技术特点以及应用范围，今天再来聊聊RAPID引物探针的设计原则要点以及其中可能会遇到哪些BUG？ 做分子检测的朋友们对PCR技术应该都是非常熟悉了，在PCR中，引物的设计都已经有一套成型的protocol，按照这个protocol来进行引物设计，一般都能得到想要的结果。即使结果与预期有差距，通过改变反应条件，如更改退火温度，调整延伸时间等，都可以在不改变引物的条件下，达到预期目的。因此，做PCR的小伙伴们，都可以根据文献中报道的引物，很轻松的就能按照文献中的protocol，达到想要的结果。 那么RAPID的引物、探针设计原则及要点有哪些： 设计原则 1.引物长度一般在30-35nt之间，可以大于35nt，不要小于30nt； 2.扩增子最好不超过500bp，一般在100-300bp之间； 3.如要进行探针检测，设计时须注意为探针留出足够的序列空间，探针长度不低于45nt； 4.探针修饰不是中间插入dSPacer，而是将一个碱基替换为dSPacer； 5.一般在设计引物探针时，尽量避免重复序列，一般不要超过3个； 6.先设计探针，再设计引物，更符合经济效益原则。 设计要点 1.5’端(3-5nt)序列应避免出现重复的G; 2.3’端(后3nt)序列最好有G或C； 3.GC含量在40-60%之间； 4.TM值对引物影响不是太大，不是关键因素 ； 5.避免引物内、引物间出现结构。 另外， PCR 引物可以用于 RAPID，具有 PCR常用长度(例如18-23bp)的引物可用于RAPID反应。不过反应可能会稍慢，如果想要快速扩增，还是建议使用稍微长一些的引物。 而大部分利用聚合酶的 5'-3'核酸酶活性的PCR探针不能用于 RAPID。 有些小伙伴会发现，在PCR中运行很好的策略，在做重组酶聚合酶扩增（RPA）/RAPID的实验中不管用，或者说是效果差，这到底是怎么回事呢？ 除了上面说的原则以外，还需要注意以下几点： 01 在PCR实验中，控制反应条件的因素，主要是温度因素，通过优化不同反应阶段的温度，来达到实验预期目的。而在RPA/RAPID实验中，反应温度（一般为37℃）是固定的，反应体系一般也是整合好的，唯一能改变的条件就是引物。 02 虽然目前PCR仪器厂家很多，但对于温度这一物理因素，都是可以做到统一控制的，因此，即使使用不同的PCR仪器，设置相同的条件，都是可以达到相同的效果。目前生产重组酶聚合酶扩增试剂盒的厂家目前也有很多，但由于重组酶聚合酶扩增试剂盒是由多个酶参与的复合酶体系，其相对复杂，而这些体系的配比都属于各个厂家的核心机密，因此不同厂家之间无法做到统一。 因此， 如果用做PCR的思维方式来做RPA / RAPID，就会发现，在设计了一对引物后，往往达不到预期效果。 于是，有的小伙伴为了快速出成果，就想到一种“捷径”，购买市面上多个厂商的重组酶聚合酶扩增试剂盒，通过使用固定引物来测试不同厂家的试剂效率。这样会导致这样一种后果，不同的项目，不同的重组酶聚合酶扩增试剂盒效果也不一样，在实际操作中很容易用混乱，不利于管理工作。 这种通过固定引物，来筛选重组酶聚合酶扩增体系的方法，看似是“捷径”，实际上要购买大量不同厂商试剂，每个项目都需要进行各种比较，浪费了大量的物力财力，是不划算的。 那么应该怎么做呢？ 首先在RPA / RAPID体系中，进行引物筛选，进行引物筛选，进行引物筛选，重要的事情说三遍。 将反应体系固定，设计不同的引物对，通过对引物的筛选，得到达到预期的引物，这样看似复杂，实际上是最快捷的方式。一般在筛选9对引物，基本上都能得到达到预期效果的引物组合，这个筛选过程，一般一天就能完成。 这样就导致另一个问题： 有些小伙伴使用某一个厂家生产的重组酶聚合酶扩增试剂盒，筛选出一对较好引物。在灵敏度、特异性等方面的评价均较高，但基于多方面综合考虑，仍然想使用乐尚的RAPID试剂，可不想再筛选引物，那又该怎么办呢？ 别着急，如果之前使用乐尚生物的RAPID试剂盒筛选出引物的小伙伴，乐尚生物将为您继续提供高质量稳定的RAPID试剂盒；如果是使用其他厂商试剂盒筛选出来的引物，乐尚将会提供特殊定制的不同反应体系，来达到您之前同样的实验效果。 |
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