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多肽分析过程中常见问题解读
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小分子越来越难做，大分子发展很强势，似乎成为了近年来药物研发市场的重要表现之一，“多肽”类药物正是其中的一大热门。目前多肽药物的质量监管日趋渐严，在这种趋势下，寻找能满足更高分离度，灵敏度的分析方法就显得尤为重要。很多小伙伴在在开发多肽类样品分析方法中总是遇到各种的问题，无比烦恼。这里小编就总结了一些在多肽方法开发中常见的问题分享给各位小伙伴。刚兴趣的也可看看多肽药物系列文章。 1、多肽含量与多肽纯度有什么区别？ 一条多肽产品中除了多肽本身还包括生产过程中带入的水份及有机盐分等杂质，多肽纯度仅指多肽本身所含肽产品的含量及杂质的含量，不包括水份等杂质；而多肽含量则是指目标多肽在产品中的净含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法来检测；因此一条多肽即使纯度达到99%，因为产品中还包含水份及有机盐分等，它的含量可能也只有70-80%。 2、如何溶解多肽？ 多数多肽都可以用超纯水溶解，对于一些难溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，对于酸性多肽，可先以小量碱性（如0.1%氨水）溶液溶解，然后稀释至所需浓度，对于碱性多肽，可先以小量酸性（如醋酸，三氟乙酸）溶液溶解，然后稀释至所需浓度，对于疏水性多肽，可用有机溶剂溶解，如DMF，甲醇，丙醇，异丙醇，DMSO等。 3、为什么流动相中要加入三氟乙酸作为离子对试剂，还有哪些流动相体系或离子对试剂可用于多肽的分离纯化？ 加入三氟乙酸能调节洗脱液的PH，同时作为离子对试剂与多肽相互作用，从而增强分离效果，明显改善峰形。 其它可用于多肽分离纯化的流动相体系或离子对试剂包括醋酸体系，磷酸体系，盐酸体系，七氟丁酸等通过适当的调节PH都能取得很好的分离效果。 另外三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去，另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm，对多肽在低波长处的检测干扰很小。 4、检验多肽的色谱柱出现柱压升高，柱效下降该如何解决？ 日常对色谱柱冲洗维护可以遵循色谱柱出厂说明书，但是在分析多肽等蛋白质样品时还容易出现一种现象：蛋白污染。主要是柱头端填料出现结块，如果出现蛋白污染，建议使用乙腈-水-三氟乙酸 = 50-50-0.1小流速反向冲洗60倍柱体积或者反向冲洗过夜。 5、多肽样品在新的硅胶基质色谱柱上不出峰或者峰面积异常小，这是为什么？ 这是因为全多孔球形硅胶柱上的非特异吸附位点对多肽产生死吸附从而导致不出峰。 色谱柱中非特异性吸附位点主要来源于残留的硅醇基、硅胶中的残留重金属、键合相脱落后暴露的硅羟基，柱管内壁没有被钝化的位点。这些都会对多肽样品有较强的非特异性吸附。 其实在开始使用新色谱柱时，对生物样品这样的非特异性吸附会比较严重，可以对色谱柱进行高浓度样品饱和处理。在正式检测前预先进样，使样品在柱子上累积，覆盖住这样的位点，才会使我们以后的分析有好的色谱图。建议隔一分钟进一次样，连续进十几针，用过量样品覆盖掉非特异性吸附位点。等峰面积，峰形稳定后就可以正式检测样品。 6、TFA在缓冲液中是不是只起到调节PH的作用？TFA的浓度越高基线漂移越厉害，那是不是说TFA的浓度在缓冲液PH允许的情况下越低越好？ （1）TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1%，过高的浓度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响柱子寿命。 （2）同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。有时0.1%TFA分离不好的话。可以考虑加大浓度到0.2%。但要注意用完后及时冲洗色谱柱。 7、在多肽检测过程中经常出现基线漂移的原因是什么？怎么解决？ 固定三氟乙酸浓度的梯度洗脱有时会在210-220nm检测处造成吸收基线的漂移，这是许多反相分离中基线漂移的原因。 降低或消除由于三氟乙酸光谱吸收变化引起的基线漂移需要尽量使检测波长靠近215nm，并在溶剂B中比在溶剂A中少加15%的三氟乙酸补偿基线漂移。例如溶剂A中的三氟乙酸为0.1%时，溶剂B中可用0.085%。 8、如何选择纯化过程中使用的色谱柱填料？ 不同序列的多肽理化性质及疏水性有很大的区别，多数情况分子量小于4000和亲水性多肽用Ｃ18柱分离效果最佳，分子量大于5000和极端疏水性的多肽以Ｃ4柱分离效果最佳，而Ｃ8柱介于Ｃ18和Ｃ4柱之间，其应用效果与Ｃ18柱更相似；对一些特殊选择性的多肽，也可选择苯基柱。 9、另附有生物样品分析过程中常见问题和解决建议 END 关注公众号“ 质谱学堂 ”；在公众号对话框输入“中国药典”即可领取 2020版《中国药典》1~4部；分享公众号任意文章至微信朋友圈，即可获取“色谱系列丛书”共12本。 “ 质谱学堂 ”专注于质谱使用技术、生物样品分析、DMPK领域的知识内容分享 |
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