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【技术分享】荧光原位杂交技术全攻略
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原位杂交（in situ hybridization）是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子的特点，应用带有标记的（放射性同位素、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DNA 的存在并定位。 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种原位杂交方法。因为不需要放射性同位素标记，因此经济安全；还可以通过不同标记的探针，在同一个样品中同时检测多种序列。 荧光原位杂交探针的荧光标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大；直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法检测步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 原位杂交探针分类 染色体特异重复序列探针，主要用于检测染色体数目异常； 全染色体或染色体区域特异性探针，主要用于检测染色体数目或结构异常； 特异性位置探针，用于检测染色体的易位、缺失等。此外，还有用于特定RNA检测的人工合成或体外转录的探针。 荧光原位杂交实验的步骤 探针变性：将探针在75℃恒温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。 切片置于65℃下过夜烘烤。 二甲苯中室温脱蜡2次，每次10分钟，随后浸入100%乙醇中5分钟。 切片依次室温置于100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各两分钟复水。将组织切片室温浸入去离子水中3分钟，用无绒纸巾吸取多余的水分。 50℃下用30%酸性亚硫酸钠（sodium bisulfite ）处理组织切片20－30分钟。 于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。 取0.4ml蛋白酶K储存液（20mg/ml）溶于40ml 20XSSC(pH 7.0)得到蛋白酶K工作液（200μg/ml）；将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下孵育20-30分钟。 组织切片经蛋白酶K消化后，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。 将组织切片置于0.1M HCl中室温浸泡5-10分钟，于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。 将组织切片玻片依次置于-20℃预冷的70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水。 将组织切片室温浸入丙酮溶液中2分钟。 自然干燥玻片，加热玻片至56℃。 将已变性或预退火的探针10 μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（为防止杂交液蒸发，此过程在湿盒中进行）。 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5 min。 在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5 min。 自然干燥玻片，DAPI复染。 荧光显微镜观察结果。 |
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