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【实验外包】高质量染色切片要知道 已有1人参与
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苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法简称HE染色方法 是常规病理制片最基本的染色 能够对正常组织和病理组织进行形态结构的观察。 一、实验原理 1、细胞核染色的原理·苏木精为碱性天然染料 可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA 在 DNA的双螺旅结构中 两条核苷酸链上的磷酸基向外.使DNA双螺旋的外侧带负电荷.呈酸性.很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色 所以细胞核被染成蓝色。 2、细胞浆染色的原理:伊红是一种化学合成的酸性染料 在一定条件下可使细胞浆着色。细胞浆的主要成分是蛋白质.为两性化合物,细胞浆的染色与染液的pH在胞浆蛋白质等电点(4.7-5.0)以下时胞浆蛋白质以碱式电离.则细胞浆带正电荷 就可被带负电荷的酸性染料染色，伊红在水中离解成带负电荷的阴离子与胞浆蛋白质带正电荷的阳离子结合使细胞浆着色 呈现红色 3、分化作用:染色后用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去这个过程称为分化作用.所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液.因酸能破坏苏木精的醌型结构.使组织与色素分离而退色。经苏木精染色后.必须用0.5%盐酸乙醇分化 使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去.在进行伊红染色 才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此在HE染色中分化是极为关键的一步。 4、返蓝作用 分化之后 苏木精在酸性条件下处于红色商子状态 呈红色 在碱性条件下处于蓝色离子状态呈蓝色，组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后星红色或粉红色 故分化之后,立即用水出去组织切片上的酸而终止分化再用弱碱性水(0.2%氨水)使苏木精染上的细胞核星现蓝色 这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝,但所需时间较长。 二、实验材料和试剂: 1、苏木精染液 苏木精染液配制方法有多种Harris苏木精染液是最常用的一种 其配方如下 苏木精:2g无水乙醇:20ml硫酸铝钾:20g蒸馏水:200ml氧化汞:0.5g冰醋酸:8ml 配制步骤:先用无水乙醇溶解苏木精 用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾,再将这两种液体混合后煮沸(约1min),离火后向该混合液中迅速加入氧化汞并用玻璃棒搅拌至染液变为紫红色(此时有大量气泡产生 故容器宜大,以防液体溢出).随即用冷水冷却至室温,然后加入冰醋酸并混匀.过滤后使用。 2、伊红染液 伊红染液有是水溶性和醇溶性两种,常用的为0.5%水溶性伊红染液其配方如下伊红Y:0.5g 95%乙醇:100ml 3、0.5%盐酸乙醇分化液36%-38%盐酸:0.5ml75%乙醇:99.5ml 4、0.2%氨水(pH在7.5-8之间)25%-28%氨水:0.2ml蒸馏水:100ml 三、染色步骤与方法 1、烤片:60分钟温度60℃(目的:使组织切片与载玻片贴合的更加紧密) 2、切片脱蜡至水: (1)二甲苯I:10min(2)二甲苯Ⅱ:10min(3)二甲苯田:10min(4)无水乙醇I:3-5min (5)无水乙醇Ⅱ:3-5min(6)95%乙醇I:3-5min(7)90%乙醇:3-5min(8)80%乙醇:3-5min(9)75%乙醇:3-5min (10)蒸馏水洗:5min 3、染色 (1)木精染色:5-10min (2)蒸馏水洗.1min (3)0.5%盐酸乙醇分化:10s/10 to 20 quick dips(4)蒸馏水洗:2min (5)0.2%氨水返蓝:约40s(6)蒸馏水洗:2x1min(7)0.5%伊红染色:5min(8)蒸馏水速洗 4、脱水、透明、封固 (1)80%乙醇:3min(2)90%乙醇:3min(3)95%乙醇:3min(4) 无水乙醇I:5min(5)无水乙醇Ⅱ:5min(6)二甲苯I:5min(7)二甲苯Ⅱ:5min(8) 二甲苯Ⅲ:5min(9) 中性树胶封固 四、染色结果 细胞核呈蓝色.细胞浆呈粉红色至桃红色.胶原纤维呈淡粉红色 红细胞呈较鲜艳的橘红色。钙盐、细菌菌落呈蓝色或紫蓝色。 五、注意事项 1、染色前,切片脱蜡应彻底。若脱蜡不彻底.则影响着色。 2、染色时间与染液的新旧程度有关 不能一成不变。新配制的染液着色力较强,染色时间可适当缩短:反之,则适当延长。伊红染色程度应以苏木精对核的着色程度为参照标准,掌握其染色时间,以达到对比鲜明为宜。 3、伊红染液的pH值不能低于细胞核染色体等电点(pl=3.3).否则染色体也可表现碱式电离带正电荷.而被伊红染液染色.便细胞浆与细胞核区分不开。因此伊红染液的pH值应小于胞浆蛋白等电点,而大于胞核染色体等电点在3.6-4.7之间。 4、掌握好分化程度分化时要认真观察 精心操作,观察切片由深蓝色变成红色或粉红色时,立即将切片置入自来水中终止分化。 5、封固用的中性树胶的浓度要适宜.避免产生气泡。如中性树胶过稀 容易溢出盖玻片的周围.且树胶内的二甲苯易挥发 树胶干燥浓缩后可产生气泡。如中性树胶过浓稠 滴后不容易扩散.有气泡不易排出。若封盾后气泡存留,既影响切片观察.又影响切片保存。因此有气泡产生时,应轻轻按压盖玻片,将气泡驱除。 6、脱蜡用二甲苯应该经常过滤并定期更换新液脱蜡时应避免将二甲苯过多地带入酒精中出现云霞现象。 7、为了加速脱蜡过程可将切片预先进行加温再行脱蜡。 8，苏木素染色时间的长短主要依据气温的高低 染液的新旧组织的差别以及组织所使用周定液不同而有所区别.很难提出一个确切的时间一般先染5-10min.取出后返蓝 镜下观案.若染色不足,可延长染色时间。 9、苏木素使用一段时间后.表面易出现亮晶状氧化漂浮物.必须勤过浦 否则粘附于组织上时不易去掉.苏木素液颜色为灰蓝色时应弃掉换新液。 10、盐酸酒精分化是苏木素染色的关键 分化时间长短很难确切说出只有凭经验来控制操作.分化时细胞核以外成分首先脱色 其次胞核开始脱色 分化时应随时在显微镜下观室.便组织着染适度 分化鲜明,一般在盐酸酒精中将组织分化成淡粉色为宜。 11、分化适度的切片应立即用水冲洗.否则残存在切片上的盐酸酒精仍然进行着脱色作用,冲洗时水流不宜过大,以防脱片冲洗时间不应少于10min。 12、为了缩短冲洗时间.可用返蓝液,但必须充分水洗,否则影响伊红的着色。13、伊红应该淡染,以免喧宾夺主.应该色彩对比适当鲜明艳丽 14、组织切片的脱水,透明等必须彻底,否则切片易呈云雾状,难以镜检。脱水用酒精必须定期检查更换以保证有效浓度。 15、切片有脱落现象时可用05%稀火棉胶液防止切片脱蜡至纯酒精后 如火棉胶液浸半分钟 取出稍干如80%酒精中硬化火棉胶.然后入水洗.进行染色。 0.5%火棉胶配方纯酒精90ml乙醚90ml 5%火棉胶液20ml |
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