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【实验外包】教你提高RNA抽取高得率!
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我们都知道RNA提取过程中最重要的注意事项是防止RNA酶的污染导致实验失败,下面我们总结了一些实验技巧.以帮助提取更高质量的RNA。总的来说做培养细胞的RNA提取比较容易.用普通的trzol(国内外均可)只要准备充分.操作的准确,这样提高RNA抽取高得率一般是没有什么问题的。 RNA提取失败经验总结 1、环境污染影响RNA提取，皮肤携带的细菌霉菌等微生物及人体自然脱落下来的皮屑都可能成为 RNA酶的来源从而影响RNA的提取。因此要培养良好的无菌操作习惯.预防微生物污染。 2、操作时勤换手套 戴手套口罩冰上操作动作迅速。最关键的一步也是决定RNA质量的一步是:离心后.出现分层RNA在上清中中间是DNA下面是蛋白。这里一旦不留意中间的DNA就会混入从而影响 RNA质量。这里要提一个小技巧,为了提高RNA的质与量,离心后不要马上吸取含有RNA的上清液,而是移取中层的DNA和下层的蛋白。余下的下层油相(10%~15%)经短暂高速离心之后再吸取上清含有RNA的水相。其实这一技巧可用于所有的分层液相的实验如酚抽提DNA的实验 回收胶中DNA的实验。 3、对于组织而言.研磨是关键之一。在提取组织样品时.就得充分研磨组织.等组织块成为粉末后再加入Trizol试剂。常用的研磨方法是液氮研磨法，研磨后离心去处沉淀,不要在细胞离心后马上加入Trizol试剂。因为成团的细胞加入Trizol试剂后.外围细胞先期施放出的大分子DNA.聚积成团,干扰成团里层细胞的裂解.即使用加样枪或针头反复吸取.也无法彻底打断已经成团的DNA研磨过程中有三个关键步骤研磨器皿高压灭菌烘干水汽后,-80放置过夜,预冷冻组织块的表面积尽可能大切不可成球状，一旦用力研磨.球状的组织块极易飞出研钵加入足量的液氢让组织块完全冻透一次将组织块研磨好。在没有冻透之前千万不能研磨 如一次 没有研磨好下一次研磨的效果就差 且第二次加入的液氮会将前一次所产生的干粉带出研钵,使其飞溅在研钵的四周。这一技巧同样可用于分离提取组织块的DNA或蛋白质。 4、使用Trizol试剂时其中的一种成分能抑制RNA酶所有RNA样品泡在Trizol试剂中是不可能被RNA酶消化的。但是 对样品的后续操作会要求用无RNA酶的玻璃器用或塑料器皿。玻璃器加可以在150的烘箱中烘烤4h。塑料器血可以在0.5mo/L的NaOH中浸泡10min,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用 5、用0.01%的DEPC或Erasol水溶解RNA时,原则上是要根据沉淀的多少加入相应的体积,考虑到新手一开始经验不足 可以少加,浓度大可以再稀释。提取完RNA后跑电泳检查有无DNA污染和RNA降解.然后-80保存。实验后要注意:超净台需用70%乙醇擦拭 再用DEPC或Erasol除去空气中的RNase.提取RNA所需的Tip和EP管要提前用0.1%的DEPC或Erasol水处理以除去RNase.DEPC处理还需高压。其实RNA贮存在70%的乙醇中远远要比贮存于DEPC水中稳定在-80可保存数年,有些甚至10多年后还可以用. 有两种操作方式: 乙醇或异丙西沉淀后如不马上要用.直接换成70%乙醇-80保存 用时再来分析RNA的质是和数量常规的处理后了解RNA的质和是 再加入3倍体积的无水乙醇 再-80保存当然 这两种贮存方式都要在RNA不是马上要用的前提下进行。如果提取的RNA比较多 可以先雀取一部分样品进行马上进行的实验 另一部分贮存于70%乙醇,以备后用。 6、Trizo试剂提取RNA所用到的一次性试管要确保没有破损能够耐受12000g的离心力实验用水相当重要必须用DEPC处理过的无RNase水。配制过程是在去离子水中加入0.1%的 DEPC.摇过夜之后.高压分解残留DEPC。。提取时所有与Trizol试剂有过接触的器血都要泡存水中吸取出来的Trizol试剂也要直接加入含有大是水的玻璃杯中 7，Trizol提取RNA时要注意戴手套和护眼罩.因为Trizo试剂含有酚等有机溶剂，操作要在通风橱完成避免人呼吸道吸入。同时温度应该控制在15-30 RNA抽提的10大窍门 1、快速组止Rnase活性。样品收集后快速冷冻 裂解时快速操作灭活Rnase 2、选摆合适的抽提方法。高核酵含量的绝织 脂肪组织愚好用含苯酚的方法 3、预判质量要求。Northern.cDNA文库构建对完整性要求高.RT PCR.RPA(Ribonucleaseprotectionassav)对完整性要求不是很高。RT-PCR对纯度(酵抑制物残留)要求很高。 4、彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键 5、检查RNA的完整性，电泳28S:18S=2:1是完整的标志.1:1对大部分实验也是可以接受的 6、去除DNA。用于RT-PCR.arrayanalysis最好用Dnase|去除DNA。 7、降低外源酶的污染，不能从外面又导入酶。 8、低浓度的核酸浓缩时.要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及DNA污染。 9、彻底溶解RNA 必要时可以65℃加热5分钟。 10、合话的保存方法，短时间可以-20C保存长期请保存于-80°C 提高RNA得率的方法 1、使用更有效的破碎/匀浆方法。RNA如果不能被有效释放出来,得率是会降低的。液氣捣碎、酵消化破壁(Lysozyme/Lyticase)、电动匀浆器匀浆,虽然麻烦,但都是获得高得率的有效手段 2、抽提试剂的更换。假如得率低不是由匀浆方法不彻底引起.则可能是所使用的试剂的裂解能力差导致。最合理的做法是:使用更多的裂解液 用完后换厂家。另外 可以改用不使用苯酚、氯仿提取的试剂方法:使用苯酚、氛仿抽提的方法由于不可能全部取出上清.RNA的损失是比较大的 3、延长沉淀时间。如果核酸浓度低.采取低温沉淀、并延长沉淀时间.可以获得非常好的效果。RNA提取过程中最应该注意的就是RNA酶的防止 所有操作在超净台完成 然后一定要带一次性手套,而且一直要换。按规程操作提高RNA高得率不是问题 |
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