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【实验外包】流式细胞术检测小鼠脾脏中Th17阳性细胞占比
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常规Th17是指T辅助细胞在各种生理与病理条件下分化为Th17的能力。静息状态下.Th0分化为Th17的能力非常弱所以外周血中极少含有Th17细胞.但是当Th0细胞受到外界因素(如刺激素.病原体等)刺激时,其中 Th0可以向Th17分化.具体分化趋向取决于细胞因子的种类。其实我们检测到的Th17实际上是检测Th细胞对刺激的反应能力。 一、刺激剂 实验中通常选用的刺激剂为PMA(佛波酯)+lonomycin(离子霉素)。 PMA为PKC(蛋白激酶C)的激活物,PKC则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化.形成级联反应,导致许多蛋白的表达.进而引起T细胞的活化。lonomycin是Ca2+的转运剂.可将细胞器内的Ca2+转运至胞浆内在细胞内。 PKC可被DAG(二脂酰甘油)和Ca++的共同作用而激活.因此在lonomycin的参与下,T细胞内PKC可被进一步激活。可见PMA与lonomycin协同活化T细胞。二、高尔基体内陷流式细胞术仅能检测细胞内的抗原.但是活化的T细胞会将多种细胞因子分泌至细胞外,因此我们还需要阻断细胞因子分泌至细胞外。 高尔基体(Golgi)是细胞分泌的核心细胞器,各种细胞因子或蛋白合成后必须经过高尔基体的加工、转运以及生物膜系统的不停融合交换才能分泌到细胞外.因此只要将高尔基体破坏即可组织细胞因子或蛋白分泌到细胞外。我们常选用的高尔基体阻断剂为BFA或Monensin,其中Monensin的阻断效果略差于BFA.但由于前者价格较昂贵.现实验中多用Monensin来替代BFA。 三、CD4内吞 CD3+CD4+是Th细胞的表面标志物但是当用PMA刺激4-6小时时.CD4+的细胞明显减少,其至消失.这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。此时我们选用用CD3和CD8反设CD4细胞,即CD3+CD8-的细胞被认为是CD3+CD4+的细胞。值得注意的是.CD4内吞现象出现在人源细胞中对干小鼠细胞 再进行PMA刺激时对CD4几乎没有影响,因此检测小鼠Th17时可直接用CD4设门。 五、实验步骤 1、单细胞县液制备:将脾脏组织置干铁质滤网均匀研磨至脾脏细胞充分脱落用PBS将滤网上粘连的脾脏细胞进行冲洗,收集洗脱下来的脾脏细胞。将小鼠腿骨进行清理,清除肌肉组织,仅留腿骨。用剪刀将小鼠腿骨两端进行剪切用注射器吸取PBS对小鼠腿骨进行冲洗,直至将骨内髓质完全洗脱为止。将洗脱的髓质均匀研磨.用滤网进行过滤 收集洗脱下来的骨髓细胞。 2、将制备的单细胞悬液500 g离心5 min,去上清.取沉淀。 3将细胞沉淀用2 mL溶而素进行重显室温反应10 min将红细胞进行裂解， 4、500 g离心5 min.去上清.取沉淀。 5、加入2 mLPBS 将细胞沉淀进行洗涤 重县后 500 g离心5 min.去上清.取沉淀 6、用1 mL RPMI培养基.吹打混匀重悬细胞。 7、细胞按1:10或1:20倍稀释.进行细胞计数。 8、取5*106个淋巴细胞进行刺激.加入PMA、lonomycin和Golgistop.37C培养4h 9、刺激完成后,500 g离心5 min,弃上清。 10、加入5 mLPBS重悬细胞,500 g离心5 min,弃上清。 11.加入100 uLPBS重悬细胞加入APC-CD4抗体1 uL涡旅混匀.室温避光反应20 min. 12，每管加2 mL细胞固定液室温避光孵育20 min.600 g离小5 min.弃上清。 13、每管加入2 mL细胞破膜液室温避光孵育10 min.600 q离心5 min.弃上清。 14、每管加入2 mL细胞破膜液.600 g离心5 min,弃上清。 15、加入FITC-IL17A抗体1 uL涡旋混匀室温避光孵育30 min。 16、每管加入2 mL细胞破膜液.600 g离心5 min,弃上清。17、每管加入300 uL PBS.涡旋混匀,上机检测。 |
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