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细胞衰老检测方法与步骤
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细胞衰老是细胞在正常环境条件下发生的功能减退、逐渐趋向死亡的现象。众所周知，衰老的细胞表现为细胞体积变大，呈扁平状；细胞核变大，核膜内陷，染色质聚集、固缩、裂解；胞质内颗粒增加，有空泡形成；线粒体的数目及形状发生改变；膜流动性降低；溶酶体内容物增多，导致溶酶体酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老细胞所具有的上述特征成为各种细胞衰老检测手段的依据。 其中，对衰老相关β-半乳糖苷酶的检测是有效检测细胞衰老的经典方法。X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）是β-半乳糖苷酶的底物，X-Gal本身无色，经β-半乳糖苷酶水解后产生半乳糖和蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝。利用X-Gal的这个特点，可以间接对β-半乳糖苷酶的活性进行测定。衰老细胞中的溶酶体内容物通常增多，使得溶酶体酶β-半乳糖苷酶的活性升高，故可以X-Gal作为底物对细胞衰老的情况进行检测。 细胞衰老检测方法与步骤 （1）细胞接种前在6孔培养板中预先放置灭菌的细胞片，每孔加入1×10E5个细胞，37℃ 5% CO2条件下培养过夜，使细胞在细胞片上生长。 （2）在超净工作台中吸弃6孔培养板中的培养液，加入×1 PBS，洗涤细胞1次，随后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，室温条件下固定3~5分钟。 （3）吸弃2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，加入×1 PBS，洗涤细胞3次，每次3分钟。 （4）吸弃×1 PBS，加X-Gal溶液以浸没细胞片为宜，37℃孵育4~8小时或过夜，用保鲜膜包被6孔培养板以防染液蒸发。 （5）取出细胞爬片，去离子水冲洗2次，再次用固定液固定4分钟，流水轻轻冲洗。 （6）将细胞爬片按此顺序脱水、透明∶95%酒精I（2分钟）→95%酒精Ⅱ（2分钟）→100%酒精I（2分钟）→100%酒精I（5分钟）→二甲苯I（2分钟）→二甲苯Ⅱ（2分钟）。 （7）中性树胶封片。 （8）在普通光学显微镜下观察衰老细胞形态。 每张片子镜下计数400个细胞，确定X-Gal染色阳性细胞（衰老细胞）在细胞群体中的所占的百分比即衰老细胞率（蓝染细胞数/总计细胞数×100%）。 细胞衰老检测注意事项 ①X-Gal溶液需要现用现配。 ②细胞固定时间过长或固定之后清洗不干净，均会影响后续的酶反应。 |
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