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【百奥实验方法】侵袭迁移
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Transwell细胞迁移实验实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室上下层培养液以聚碳酸酷膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酷膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不司不经和经过不同外理的聚破酸酷膜，就可以进行共培养，细胞趋化，细胞迁移，细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 一、材料准备可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8um，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清 DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基(也可加到20%血清)，无菌PBS，棉签，胰酶，甲醇，结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫) 二、步骤和流程 1.基质胶铺板用BD公司的Matrigel1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释，包被Transwel小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matriqel聚合成经胶。使用前进行基底膜水化。2.2制备细胞县液1制备细胞县液前可先让细胞撒血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 2.消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，(用PBS洗1-2遍)，用含BSA的无血清培养基重暴。调整细胞密度至5x105/m。 3.接种细胞1.取细胞县液100u加入Transwel小室。2.24刊板下室一般加入600ul含20S的培美基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。3.培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。4.结果统计直接计数法，"贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟将小室适当风干。0.1%结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 |
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