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北京艾柏森铁虫 (小有名气)
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转基因小鼠鉴定方法
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一、 从鼠尾中提取DNA 采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒提取DNA，操作如下： 1. 剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180μL Buffer GTT。震荡混匀。 2. 加入20μL proteinase K，涡旋震荡，彻底混匀。 3. 置于56℃水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡，使样品均匀分离。 注意： 1） 如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20μl proteinase K消化，不会影响后续操作。 2） 如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。 4. 14000rpm 离心 1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。 5. 加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀，加入200μl 无水乙醇，涡旋振 荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 注意： 1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。 2） 如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。 6. 将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可分多次转入。10000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 7. 向吸附柱中加入 500μl Buffer GW1（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8. 向吸附柱中加入 500μl Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。 9. 12000rpm 离心 2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR等）。 10. 将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm 离心 1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。注意：1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5直 接，PH值低于7.0时洗脱效率不高。 2）离心前室温孵育5min可增加产量。 3）用另外的50-200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。 4）如果需要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10；若洗脱体积小于200μL，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。 二、PCR PCR程序设定：根据转基因类型及引物设计而改变 设定PCR反应体系 先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq酶混合均匀，最后再在各PCR管中依次加入DNA样品。 引 物处理方法：引物合成后，EP管上会有标记，一般为x nmol，使用前先用12000rpm 离心 1min，加入10x μl ddH2O，涡旋振动混匀，微型离心机离心，即可得到100μM的母液，取10μl 的母液，用ddH2O稀释10倍，即加入90μl，混匀后即可得到10μM的引物工作液。 三、 电泳 1． 配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种，分别用的梳子为50、25、11齿。分别用的0.5*TBE的量为90ml、45ml、25ml。用1.5%的琼脂糖凝胶。 2． 点样：12μl的DNA，Marker加5μl。点样时注意逐个点样，不要点错，最好把中间的那个孔留着点Marker，这样可避免点样的出错。Marker的选择依基因片段大小而定。 3． 跑电泳：打开电源，150v电压，30min左右即可。 4． 照胶：看是否有目的条带，即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子。 5． 保存。 |
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