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北京艾柏森铁虫 (小有名气)
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[交流]
质粒DNA提取实验
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在我们的细胞实验中经常会用到质粒DNA，那么具体是怎么来的呢？今天讲的是DNA的提取步骤，各位接好了哟~~前提细菌繁殖步骤（挑单克隆，置于LB培养基中，置于37℃恒温摇床摇过夜，180-200 rpm）。 一般市面上有很多试剂盒可供大家使用，大体步骤都差不多的啦~~我按照我所使用的试剂盒（AxyPrep中抽试剂盒）的步骤分享如下： 收集1. 50 ml离心管收集过夜摇菌的LB培养液（此时可以做一下判断，如果液体未变浑浊，说明细菌并未繁殖成功，这样肯定难以提出DNA；如果液体浑浊，便说明细菌繁殖成功啦，可继续下面的操作）,6000 g离心8 min，弃上清。 裂解2. 加250 μl Buffer S1 重悬细菌的沉淀，可以在涡旋仪上涡旋，使得沉淀全部重悬均匀，不留有小的菌块。 3. 加250 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min。 中和4. 加350 μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10 min。 5. 质粒DNA制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管中， 开启并调节负压至-20-30英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。 结合6. 加500 μl Buffer W1，吸尽管中溶液。 7. 加700 μl Buffer W2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。 洗涤8. 将制备管置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中，12,000×g离心1 min。 洗脱9. 将制备管移入新的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加60-80 μl Eluent或去离子水，室温静置1 min。12,000×g离心1 min。 将Eluent或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。10. 最后去检测其浓度即可啦。 之前也用过其他的试剂盒，步骤大同小异，根据说明书步骤操作就可以了，这个实验比较简单的啦。 |
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