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实验经验-多肽的溶解和保存
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建议先用少量肽来试验最适溶解方法，只有当多肽完全溶解后，才能加入溶液并将之稀释至最终浓度。即先溶解，后加入缓冲液。注意：总是将多肽加入到适当溶剂中搅拌，而不能采用其它方式。 冻干多肽的溶解 多肽溶解中的主要问题是二级结构的形成。 虽然疏水肽链二级结构的形成更明显，但除了最短的肽链外，该现象发生在几乎所有肽链，与极性无关。因此，溶解多肽的第一个原则是用无菌的蒸馏水或去离子水 (如果条件允许则用无氧水)。 多肽溶液可能遇到细菌降解。为避免该现象的发生, 多肽应溶解在无菌的蒸馏水中, 或者用 0.45 或 0.2 μm 孔径的滤膜过滤除菌。 包含 Cys、Met、Trp 的多肽特别容易氧化, 因此应该溶于无氧的水中。无氧水可以通过注入惰性气体 (氮、氦、氩) 减压除气得到。 若多肽不溶于纯水，超声处理有助于打碎颗粒并增加溶解度。注意: 超声处理会引起溶液发热和多肽降解。 若多肽中包含多个碱性氨基酸，使用（1-10%）的乙酸水溶液；对于疏水性非常强的多肽，则使用 50% 乙酸。 若多肽中含有大量酸性氨基酸，可用氨溶液（1-10%）或乙酸乙基吗-啡或重碳酸盐等挥发性的碱性缓冲液溶解。pH 值在层析前必须调整。 异-丙醇和乙-腈能溶解中等大小的肽。若肽要上柱，有机溶剂的量则必须很少，否则将严重影响停留时间。 若多肽因为含有 Val、Leu、Met、Phe、Tyr、Ala 等芳烃侧链而高度疏水，或为中性肽时, DMF 或 DMSO 等膜变性剂的使用，有助于多肽的溶解。 高浓度膜变性剂通过破坏多肽的二级结构而助溶。 膜变性剂适于多肽分析液的制备, 但可能会对其生物活性的研究工作造成干扰。 DMF 是最佳变性剂 (最高浓度可达 30%), 滴加至多肽溶解。 反相层析时, DMF 将与洗脱液前峰一起流出, 依注入量的多少, 峰值可能很高。大多数肽能在大量 DMF 流出后几分钟内流出, 若肽链很小, 洗脱太早, 多肽的量将降低。 冻干多肽的保存 所有标明「保持冻干」的产物, 都必须保存在冰冻条件下，最好 -20℃，若保存在 -80℃ 以下, 大多数肽可维持几年的活性。 当使用冰冻产品时, 开盖之前, 瓶或试管应在装有新鲜干燥剂的干燥箱内升至室温。对于保存于 -20℃ 的产品, 这个过程需要一小时或更长, 随包装大小而异。否则, 当瓶打开时, 水气进入导致多肽凝缩而降低其稳定性。一旦打开, 应迅速称量完毕, 并立即密闭以免潮解, 尤其亲水肽更应注意。 多肽溶液的保存 多肽溶液比干粉的稳定性差很多, 为了得到最好结果, 遵循下列原则： 反复冻融有损于肽的活性, 所以建议分装成小包装保存。需要多少解冻多少, 用后剩余者弃掉。 溶于 pH5-7 无菌的缓冲液中, 贮存于 -20℃。 包含 Cys、Met、Typ、Glu、Asp 的多肽易于氧化, 因此须保存在无氧化剂的环境中。 由于细菌能降解多肽, 因此贮存前必须过滤除菌。 |
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