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北京艾柏森铁虫 (小有名气)
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质粒提取鉴定及保存
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（1） 质粒的提取 (Tiangen质粒提取试剂盒)： a） 挑菌： 选取培养板中大小中等的单个菌落， 消毒牙签接种到10ml摇菌管中， 其中含有卡那霉素的LB约5ml， 37 °C， 220rpm恒温摇床中震荡培养过夜。 b） 取上述2.0ml培养液， 于常温下12000 rpm离心1分钟， 弃上清， 干燥沉淀。 c） 加入250μl溶液P1(配有去RNA酶， 4 °C保存)， 涡旋振荡， 完全悬浮细菌，不能留有沉淀， 否则会影响裂解。 d） 加入250μl溶液P2， 快速上下颠倒8次， 常温静置3分钟， 可见混合液逐渐变清、 粘稠， 表示已充分裂解。 e） 再加入350 μl溶液Ⅲ， 快速上下颠倒8次， 可见白色絮状物出现。 f） 常温12000rpm离心10分钟， 所得上清液倒入已经用BL平衡过的过滤柱中，注意不要倒入白色絮状物沉淀， 静置3分钟， 12000 rpm离心1分钟。 g） 加入500 μl溶液PD， 12000 rpm离心1分钟。 h） 加入600 μl溶液PW， 12000 rpm离心1分钟； 此步骤再重复1次； 弃废液后空管再次12000 rpm离心2分钟。 i） 于超净台通风干燥， 放置2-5分钟， 加入33μl已加热至65 °C的已灭菌的ddH 2 O， 室温静置3分钟， 12000 rpm离心2分钟， 得到相关质粒DNA， 测浓度， -20 °C保存备用。 （2） 质粒鉴定及保存 取100ng上述提取的质粒， 进行酶切（反应体系见前）， 随后用0.8%琼脂糖凝胶电泳以鉴定（方法同前所述）， 最后将粗略鉴定正确的样本送至生物技术公司测序。 如测序正确， 用50%灭菌甘油300μl+700μl的菌液， 标记于-80 °C保存备用。 11） 质粒或PCR产物纯化（胶回收） （1） 琼脂糖电泳酶切或 PCR 相关产物。 （2） 在紫外投射反射仪割取含有目的片段的琼脂糖凝胶片段， 割取要迅速， 以避免紫外线对 DNA 的损伤， 但注意尽量割取目的片段， 减少无目的片段的凝胶量， 以便提高纯化回收效率。 （3） 用天平称先称区空 EP 管重量， 再称取含有凝胶的 EP 管重量， 计算得到凝胶重量（mg）， 加入等量体积（μl） Bindingbuffer（如 1 mg=1 μl）。 （4） 将含有凝胶的 EP 管置入 60 °C 恒温水浴箱中融化凝胶， 持续 8-10min，间或拿出摇匀， 以确保完全凝胶溶解。 （5） 将上述凝胶溶液转移至干净的纯化柱上， 室温下静置吸附 3 分钟。 （6） 将纯化柱 12000rpm 离心 1 分钟， 弃超滤液， 必要时可将超滤液重新离心1 次可提供纯化效率； 再次加入 100μl Binding buffer， 12000rpm 离心 1 分钟。 （7）加入 700μl Wash buffer （事先已经加入无水乙醇）， 12000 rpm 离心 1 分钟，弃超滤液； 空管 12000 rpm 离心 2 分钟。 （8） 纯化柱置于 1.5 毫升干净离心管中， 于超净台通风干燥 5 分钟。 （9） 加入 30μl 已加热至 65 °C 的已灭菌的 ddH 2 O， 室温静置 3 分钟， 12000 rpm离心 2 分钟， 得到相应的 DNA 片段， 测浓度， -20 °C 保存备用。 艾柏森提供质粒测序服务 艾柏森服务优势 艾柏森生物科技有限公司致力于基因、重组蛋白、抗体、噬菌体文库等生物制剂的研发，并致力于为客户提供一站式的CRO技术服务。 公司成立至今，以自主研发为核心，围绕大量专业技术人才，先后搭建了蛋白表达纯化平台、抗体定制平台、抗体工程平台、抗体药物平台、质量分析平台以及模式动物基因工程研究平台。以抗体药物研发一条链解决方案为基础，我们主要为客户提供重组蛋白表达生产、抗体制备、噬菌体库构建与筛选，单克隆抗体药物开发（抗体筛选、抗体测序、抗体分析、抗体人源化与亲和力成熟、表位作图、抗体工程改造与抗体药效学）、稳定细胞株构建与cGMP生产、细胞免疫(CAR-T/CAR-NK）、蛋白晶体学、蛋白质组学、生物信息学、药理毒理学等技术服务。 |
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