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虫儿飞飞小

新虫 (初入文坛)

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[交流] 干货干货！一篇文章带你get蛋白质样品制备方法-百泰派克生物科技分享已有1人参与

在蛋白质组学研究中，蛋白样品的制备是整个研究的第一步也是关键一步，直接影响到蛋白质组研究结果。目前没有一种蛋白质样品制备方法能适用于所有的生物材料，因此在实验前，应针对不同的材料和研究目的（比如是要提取出尽可能多的蛋白质还是仅仅捕获感兴趣的目标蛋白）选择适宜的蛋白质样品制备方法。
  蛋白质样品的制备包括以下步骤：1. 样品的破碎与裂解; 2. 蛋白质的沉淀; 3. 蛋白质组分的纯化

  一. 样品的破碎与裂解
  1. 机械破碎法：
  （1）研磨法——常用于固体材料或组织材料的破碎；将剪碎的组织材料至于研钵或匀浆器中，加少适量石英砂研磨成匀浆。或者先用液氮预冷研钵，然后将冷冻保存于液氮中的组织研磨成粉状。
  （2）组织捣碎法——常用于固体材料或组织材料的破碎；用家用食品加工机将组织打碎，然后用内刀式组织捣碎机以10000~20000r/min的转速破碎细胞，通常捣碎10~20s暂停10~20s，反复多次。
  2. 物理破碎法：
  （1）超声波处理法——常用于组织培养的细胞破碎；利用超声波的振动力来破碎细胞，操作时应采用间断式超声，防止样品过热导致蛋白质降解。
  （2）反复冻融法——常用于细菌或组织培养的细胞破碎；将待破碎的细胞冷却至-15~-20℃，然后在室温或40℃下迅速融化，如此反复多次。
  （3）冷热交替法——常用于细菌或病毒蛋白质提取；将样品在90℃温浴数分钟，立即转至冰浴，反复多次。
  3. 化学与生物化学法：
  （1）有机溶剂处理法——常用于动物细胞；利用氯仿、甲苯、丙酯等脂溶性溶剂或十二烷基硫酸钠（SDS）等表面活性剂处理细胞，使细胞破碎，释放内含物。
  （2）酶解法——常用于真菌或放线菌一类的微生物细胞；根据样品选用合适的酶和反应条件进行酶解获得细胞裂解液。
  （3）渗透压冲击法——适用于没有细胞壁的动物细胞；将待破碎细胞置于高渗溶液中，再转移到低渗溶液或水中，使细胞吸水胀破释放内含物。

  二. 蛋白质的沉淀
  蛋白质的沉淀就是从获得的细胞提取液中选择性的分离、浓缩蛋白质，这里介绍几种常用的蛋白质沉淀方法：
  1. 盐析法：①用＞50mmol/L的EDTA溶液处理细胞裂解液，使蛋白质最终浓度大于1mg/mL；②加入硫酸铵至所需要的浓度，搅拌10~30min，离心沉淀蛋白质；③利用透析、超滤或脱盐柱等方法去除残留的硫酸铵杂质。
  2. 有机溶剂沉淀法：
  （1）三氯醋酸（TCA）沉淀法：①将TCA加到提取液中，使其终浓度高达10%~20%；②冰上沉淀30min；③离心收集沉淀，用乙醇或丙醇洗去残留的TCA。
  （2）丙酮沉淀法：①在提取液中加入3倍体积的丙酮，-20℃处理2h；②离心收集沉淀，空气干燥或冷冻干燥去除残留的丙酮。
  （3）TCA/丙酮沉淀法：①将提取液置于含有20mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）或0.07%巯基乙醇的10%的TCA溶液中，-20℃处理45min；②离心收集沉淀，用含20mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）或0.07%巯基乙醇的预冷的丙酮溶液进行清洗；③空气干燥或冷冻干燥去除残留的丙酮。
  （4）苯酚提取法：①在提取液中分别加入1.5倍体积的苯酚和酚提取液，5000r/min离心10min，收集上清液；②加入1倍体积的酚提取液，5000r/min离心10min，收集上清液；③ 加入0.2倍体积的甲醇溶液，-70摄氏度保存过夜；④离心，清洗沉淀，加入200ul的甲醇溶液，再次离心去上清；⑤重复上一步骤，向沉淀中加入80%的丙酮200ul，离心收集沉淀，并保存在-4℃备用。
  3. 聚乙二醇（PEG）沉淀法：①100mL提取液中加入100~150mL50%的PEG溶液，缓慢搅拌60min，至沉淀完全；②离心收集蛋白质沉淀。

  三. 蛋白质的纯化
  经分离的蛋白质样品常常含有一些非蛋白类杂质，如核酸、多糖、色素、去污剂、代谢物等，可以通过以下方法去除，纯化蛋白样品。
  1. 核酸沉淀法去除核酸：①在蛋白样品中加入少量脱氧核糖核酸酶，4℃保温0.5~1h；②离心去除沉淀，收集蛋白上清液。
  2. 抑制剂去除多酚类物质：植物组织多含有酚类物质，在细胞破碎过程中加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可以吸收酚类物质。
  3. 透析法去除盐离子：通常采用透析法去除样品中的盐离子，透析脱盐非常有效，透析可能会造成蛋白样品的浓度降低，可以通过真空浓缩增加其浓度；此外，还可以通过凝胶层析、沉淀/重溶的方法进行脱盐处理。

样品制备过程中还需要特别注意以下问题：
  1. 保证蛋白质完全溶解；2. 避免蛋白质发生降解或变性；3. 去除杂质的干扰；4. 最终获得的蛋白样品应避免反复冻融。

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