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免疫组化实验操作要点，新手快速入门必看！-百奥思科
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免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)是一门利用酶、荧光素、生物素、重金属离子等作为示踪剂，通过免疫亲和（抗原抗体特异性结合），在组织切片或细胞薄片上原位显示追踪生物体内大分子物质动态变化规律的实用性染色技术。按其主要示踪原理可以分为免疫组化（默认酶标法）、免疫荧光法、胶体金法等。 作用：通过颜色来显示蛋白质的有无、定位（胞外、胞膜、胞浆、胞核）、含量变化 样本种类： 按来源：①组织；②培养细胞 按制作方式：①石蜡片（IHC-P）②冰冻片（IHC-F）③细胞片（ICC） BOSTER 03/免疫组化实验步骤解析 01 取材 快：尽量半小时内取材完成 准：刀、剪锋利，一步到位，轻夹轻放 大小：1cm X 1cm X 0.2cm左右最宜 02 固定 何时固定？ 取材后立刻！马上！ 用什么固定？ 4%多聚甲醛或福尔马林较通用。有致密外膜用Carnoy液，活检用Bouin液 固定液用多少？ 组织体积20倍以上最宜。量少应中途换液1-3次 固定多久？ 6-24h最佳。固定后尽快包埋成蜡块（蜡块可保存几年时间而不影响实验结果），固定越久所需修复强度越大，越容易出现自发荧光及非特异性染色。 03 切片 要保存简单 ——选石蜡片 ! 要速度快 ——选冰冻片！ 要结构漂亮 ——选石蜡片！ 抗原不稳定 ——选冰冻片！ 抗原稳定 ——石蜡片冰冻片皆可！ 04 烤片 切多厚？ 石蜡片3-8μm，一般5μm；冰冻片5-15μm，一般8μm 石蜡片怎么捞片？ 水温40-45℃，组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起 烤多久？ 37℃过夜 或 60℃ 1-2h 注意：使用防脱处理的玻片，冰冻片无需烤片 05 脱蜡至水 Step1：二甲苯（7min） Step2：二甲苯（7min） Step3：二甲苯（7min） Step4：100%酒精（7min） Step5：85%酒精（7min） Step6：70%酒精（7min） 注：具体脱蜡时间可结合室温做调整，以组织上的石蜡脱干净为准。 06 灭活 ➊ 一般组织使用3%H₂O₂，室温孵育10min ❷ 内源性过氧化物酶在血管瘤、肝、胎盘、阑尾炎，坏死区域和急性炎症组织含量较高，这样的组织可以适当延长灭活时间 ❸ 显色系统为过氧化物酶（HRP）系统，该步骤建议一定要做 ❹ 碱性磷酸酶（AP）系统以及免疫荧光，该步骤可以不做 ❺ 在灭活时，如组织片中出现细小且密集的气泡，表示过氧化物酶含量过高，这时用3%H₂O₂溶液难以完全阻断，可以用0.5%高碘酸溶液室温条件孵育10min 07 抗原修复 抗原修复方式： 酶修复、高压热修复、微波热修复。微波热修复一般都能得到很好的效果 修复液的选择： 柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）和EDTA（PH8.0或9.0）。经验证，对于大多数的抗体来说后者使用效果更优 修复强度的选择： 固定时间越久，修复强度越强，旧标本修复强度强于新鲜标本 消化酶的使用： 不同的蛋白有最佳的消化酶，使用中要注意各种消化酶的最佳PH值 08 封闭 ➊ 5%BSA最常用 ❷ 血清，效果最全面 ❸ 封闭血清与二抗同源（比如二抗是山羊抗小鼠IgG，封闭液选择山羊血清），与一抗不能同源 09 抗体孵育 ➊ 单抗和多抗各有优势，按需选用 ❷ 一抗4℃孵育效果最佳，备选37℃ 1-2h ❸ 二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配，推荐驴、山羊、绵羊等种属 ❹ 二抗/SABC 一般 37℃ 孵育30 min 10 显色 ➊ DAB显色液现用现配 ❷ 建议镜下控制反应时间 ❸ 根据显色时间的长短反向优化前期的实验条件 11 复染/返蓝 ➊ Mayer`S 苏木素复染（不易过染） ❷ 碱性溶液浸泡返蓝（如氨水、饱和磷酸氢二钠溶液等） ❸ 免疫荧光实验可选用DAPI等核染料复染细胞核，无需做返蓝 12 脱水透明 Step1：70%酒精（3min） Step2：85%酒精（3min） Step3：100%酒精（3min） Step4：二甲苯（3min） Step5：二甲苯（3min） Step6：二甲苯（3min） 注：免疫荧光实验，该步骤可以不做。 13 封片 ➊ DAB显色用中性树胶封片 ❷ 免疫荧光建议用抗荧光衰减封片剂 ❸ AEC显色用水溶性封片剂 BOSTER 04/博士德组化检测结果图 GFAP （PB0046）小鼠脑组织石蜡切片，稀释比1：200，二抗为Cy3-羊抗兔IgG（BA1032），稀释比1：100，DAPI（AR1176）染核。 Vimentin （BM0135）人直肠癌石蜡切片，一抗稀释比1：200，二抗为Cy3-羊抗小鼠IgG（BA1031），稀释比1：100，DAPI（AR1176）染核。 Lamin B1（PB0640）MCF-7细胞，稀释1：100，二抗为DyLight®488-羊抗兔IgG（BA1127），稀释比1：200，DAPI（AR1176）染核。 E-cadherin(PB0583)人胎盘石蜡切片，SABC法（SA1022），DAB显色（AR1022）VWF(PB0086)人肺癌石蜡切片，SV两步法SV0002），DAB显色（AR1022）。Lamin-A/C(PB0307)人乳腺癌石蜡切片，SV两步法（SV0002），DAB显色（AR1022） |
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