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北京艾柏森铁虫 (小有名气)
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一起get人-鼠嵌合抗体制备知识点
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人-鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自鼠单克隆抗体，而恒定区则来自人的抗体。它是通过从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞表达产生。嵌合抗体既保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力，又大大减少了鼠源性在人体内的免疫原性,其半衰期明显延长，且在介导CDC及ADCC方面亦明显增强。 人-鼠嵌合抗体的应用 嵌合抗体目前主要用于药物治疗方面，与鼠抗相比，嵌合抗体既保留了鼠源可变的高亲和性，又具有人Fc段的多种免疫杀伤功能，从而大大降低了人抗鼠抗体反应的发生几率，改善了临床治疗效果，与其它小分子基因工程抗体相比，嵌合抗体作为完成的抗体分子，在体内半寿期更长，并具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。 制备方法 1.材料 大肠杆菌DH5a，大肠杆菌感受态细胞，TA克隆载体T-Easy Vector， 含信号肽及重链、轻链恒定区基因的质粒pAc-K-CH3， 分泌单抗的杂交瘤细胞，真核表达载体pcDNA3.1,小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0。 2.主要试剂 氨苄西林钠，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA酶，Trizol RNA提取试剂盒，反转录PCR试剂盒，琼脂糖，嗅化乙锭(EB), dNTPs, DNA Markes DNA凝胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒，胎牛血清，无血清培养液，二甲亚枫(DMSO),转染试剂盒Lieitaminen 2000 MTx,抗原，羊抗人IgG Fc片段HRP酶标抗体。 3.主要仪器 低温高速台式离心机，恒温摇床， 恒温水浴箱， 水平式电泳仪, PCR扩增仪，紫外分光光度计，紫外透射仪，co,培养箱，倒置显微镜，洁净工作台，酶标仪。 关键技术与方法 1. 可变区基洇克隆 1.1 RNA提取及反转录 取对数生长期的杂交瘤细胞株约107个细胞,按照Trizo1RNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA,再进行RTPCR扩增，回收纯化扩增产物备用。 1.2 扩增轻链、重链的V区基因 根据Orlandi等(1989)设计的扩增小鼠可变区基因的引物，以上述扩增产物为模板扩增抗体基因的可变区。回收重链VH (约360 bp)、 轻链VL (约330 bp)片段，插入Teasy载体，各送3份样品测序。测序所得序列在GeneBank核酸数据库中进行分类及同源性分析。 两端加入酶切位点 根据.上述PCR产物序列设计含酶切位点的引物，再次进行扩增，以使抗体可变区基因片段具有与载体相吻合的酶切位点，便于插入表达载体。回收纯化扩增产物备用。 2.嵌合抗体表达载体构建 改造含号肽及人Ig重链和轻链C区基因片段的单克隆位点设计含重链信号肽起始位点序列及酶切位点Nhe I的上游引物HLF(KOZAK+4G,即GCCGCCATGG)，和含Xho I 位点的下游引物HLR，以质粒pAc-K-CH3为模板，扩增出重链信号肽基因片段;设计含Xho I 和Kpn I 位点上游引物HCF,和含Furin(RKRR)序列及酶切位点Xba I 的下游引物HCR,以质粒pAc-K-CH3为模板，扩增出重链恒定区基因片段片段;用Xho 1 连接上述片段得到含重链信号肽、Mcs及重链恒定区的基因片段。设计含酶切位点Apa I的上游引物LLF,和含EcoR I位点的下游引物LLR,以质粒pAc-1-CH3为模板，扩增出轻链信号肽基因片段;设计含EcoR I和Hind II位点上游引物LCF，和含Pme I 的下游引物LCR，以质粒pAc-K-CH3为模板，扩增出轻链恒定区基因片段片段，用EcoR I连接上述片段得到含轻链信号肽、MCS及轻链恒定区的基因片段。 构建含号肽及人Ig重链和轻链C区基因片段表达空载体 用合成的含酶切位点(Xba I和Apa I )的2A序列连接.上述重、轻链，得到含信号肽及人Ig重链和轻链C区基因的基因片段LigC (Leader + Ig Constant 然后与NheI和Pme I双酶切过的pcDNA3.1-CA大片段连接，即得到嵌合抗体真核双表达载体pcDNA3.1-CA (chimeric antibody, CA。 双酶切表达载体pcDNA3.1-CA和纯化的VL，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段后，连接、转化大肠杆菌，筛选出pcDNA3.1-CA-VL阳性克隆，富集培养后提取质粒进行酶切鉴定。然后，双酶切表达载体pcDNA3.1-CA-VL和纯化的VH,分离纯化相应的酶切片段，重复上述步骤，构建成重组表达载体pcDNA3.1-CA-XX (抗原单词的首字母)。 3.转染Sp2/0细胞 接种适量Sp2/0细胞于培养瓶中，培养12 h后用纯化的载体pcDNA3.1-CA-XX DNA,采用Lipofectamine 2000试剂转染，按试剂盒使用说明书进行。设置空载体和无载体的细胞为对照。转染72 h后，加含MTX的选择性培养基进行筛选。2周后将生长出的阳性克隆利用有限稀释法单克隆化。 4.阳性克隆鉴定与筛选. 以间接法用抗原和酶标羊抗人IgGFc片段抗体检测嵌合抗体的特异性及重组性。以适量抗原包被酶标板，加细胞培养上清反应后，再加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶标抗体(经鼠Ig吸附过)孵育，显色后测A490吸光值。 5.抗体腹水生产 腹腔种植转染瘤细胞,5~7天后抽取腹水。-只种植杂交瘤细胞的小鼠有时可产生多达10ml的腹水。王硕等(2003 )报道称从腹水中获得的嵌合抗体产量可达1~2 mg/mlb |
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