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木杉1123

新虫 (初入文坛)

[交流] 毕赤酵母蛋白表达不出来… 已有6人参与

求助各位虫友们,我的毕赤酵母GS115+载体ppic9k,蛋白大小不到20kD,前面的步骤都做的没问题,也进过核酸电泳验证过了,可是到了蛋白表达这一步,就是不表达…

跑蛋白电泳

1,浓度太低,直接跑基本没东西。试过TCA和PEG浓缩之后,条带与空白对照没有相应条带。

2,经过镍柱纯化之后基本没有了…这样应该就是没有表达出来了。也用考马斯检测的试了一下,基本蓝色程度很低,说明蛋白不多。

基本新手,实验室没有人做过相应的内容,问了很多朋友,但是做的东西不太一样,想请教一下朋友们这下要怎么办呢,感激不尽

ps:调整pH的方法还在做,周期较长,换菌种载体什么的也不太清楚是否可以表达…

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abcjlm

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你这个蛋白本身是属于哪一种蛋白,像胞内蛋白(但不是囊体和核内的蛋白、胞外蛋白)用酵母做胞外表达是很有难度的,因为折叠环境不一样很容易胞内淤积或形成非可溶性蛋白。
6楼2021-08-26 17:24:25
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木杉1123

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by abcjlm at 2021-08-24 08:55:36
做过wb吗

感谢回复
今天最新一批才刚刚发酵出来,调整了ph之后效果还是一样,破菌之后倒是出现了其他的情况,刚跑出来的附图如下,wb因为完全不会所以还在学…不知道这个算是有还是没有,目的条带大小应该是17kd左右。
maker是14.4到97.4kD的
左边三个是空白和两组实验组TCA浓缩后的上清
右边三个是破菌之后TCA浓缩后的空白和两组
麻烦兄弟指导指导这是出来还是没出来呀,谢谢

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3楼2021-08-25 15:39:22
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forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
建议先做做毕赤酵母胞内表达。

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

4楼2021-08-25 18:48:06
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木杉1123

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by forhighbio at 2021-08-25 18:48:06
建议先做做毕赤酵母胞内表达。

感谢回复
顺便请教一下,胞内表达是要去除信号肽或者换菌株吗。最新一批电泳还没跑… 总感觉很无奈…前面几步做的都没问题,pcr验证和高拷贝都做的不错…就是表达出问题…心烦
现在好像没法发图片 上个电泳图发不出来

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5楼2021-08-25 20:42:49
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