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技术交流｜病毒转染实验方法操作步骤-北京百奥思科分享
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转染是指将外源基因导入细胞内的一种生物学技术。转染可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。物理介导方法有电穿孔法、显微注射和基因枪法,化学介导方法很多,如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导技术,生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 病毒载体是以病毒为基础进行改造而获得的载体,已经成为目前最常用的转染方式之一。通过对病毒基因组进行改造,能够使其携带外源的目的基因。将其包装成病毒颗粒后,通过侵染宿主细胞,能够将外源目的基因一并带入宿主细胞中。与传统方法相比,病毒转染在真核细胞中的效率更高,尤其是在传统方法难以发挥作用的哺乳动物实验中,病毒转染法发挥着重要的作用。 病毒转染系统的分类:目前常用的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。 慢病毒载体:慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。和普通逆转录病毒载体不同的是,它对分裂细胞和非分裂细胞均都具有感染能力。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。 腺病毒载体:腺病毒载体是以腺病毒发展出的一类载体。和慢病毒载体不同的是,腺病毒载体不会将外源目的基因或自身的病毒基因整合到宿主细胞的基因组中,而是游离在宿主基因组外独立的表达。基于这一特性,腺病毒载体能够实现外源基因的瞬时表达,同样也由于不对宿主基因组进行整合而避免了潜在的基因突变,具有更好的可控性。 逆转录病毒表达载体:逆转录病毒是一种单链RNA病毒,它是能够在逆转录酶的作用下将 RNA 转变成 cDNA,再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。根据逆转录病毒的一些特性设计出的一种复制缺陷性病毒,使其成为能够携带某种特异目的基因的表达载体,即逆转录病毒载体。 病毒转染细胞的方法(以慢病毒为例): 慢病毒转染贴壁细胞实验方法 1、 慢病毒转染前18-24小时,将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。 2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基,加入适量病毒悬液。37℃孵育。 3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。 4、继续培养24小时,用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。 5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白,一般转染48小时后可见明显荧光表达,72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率,可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选,可以在转染3-4天后开始加药。 慢病毒转染悬浮细胞实验方法 1、在2×105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒,充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时(选作,部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。 2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。 3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。 一定要注意的几点: 感染时的培养基尽量少些; 2. 每1ml的培养基中加入5-10ul的Polybrene(储存液浓度为2mg/ml ),可以提高效率约3-5倍。不过病毒感染效率的问题都是相对的,达到自己的研究目的即可。 |
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