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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细菌基因组提取不出来
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rural2084

木虫 (正式写手)
★
wanzi(金币+1):谢谢参与
我没有用过试剂盒，我用的都是传统方法，提了将近60株芽孢杆菌了，效果很好。你用的是试剂盒，我估计是哪一步操作可能有问题。
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11楼2009-08-18 11:30:42
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paulajjh

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-18 12:34
不知道你用的是哪个公司的试剂盒，我之前抽过植物乳杆菌的基因组，也有抽不出来的时候，总结两点：1   加溶菌酶和蛋白酶k要足量；2   抽的过程要小心，不要剧烈摇晃。希望对你有帮助
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12楼2009-08-18 12:33:31
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
没有产物的话就是菌体没有裂解完全，楼主加溶菌酶了没，水浴时间多少？另外楼主是用摇了多久得菌提的？
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13楼2009-08-18 19:30:28
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wolfebst

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
一般的试剂盒提革兰氏阴性菌比较好用
阳性菌一般细胞壁不容易破,会影响提取效果
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14楼2009-08-18 19:39:07
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
CTAB法绝对能够提出来,而且片段很大.试剂盒就是一个方便,但是效果不见得好.
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
15楼2009-08-18 19:44:14
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wuer413023

至尊木虫 (文坛精英)

没事领金币
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不用试剂盒用传统试剂可以吧
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上邪!我欲与君相知，长命无绝衰。山无陵，江水为竭，冬雷震震，夏雨雪，天地合，乃敢与君绝！
16楼2009-08-18 19:59:10
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cancanyeah

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可能是酚类物质存在，影响了后续pcr中酶的活性，建议你1、检查下试剂盒是否过期，2、将提取物纯化后在电泳，3、如果还不行的话，就将模板稀释一下，在p，看能否出结果
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17楼2009-08-19 08:59:11
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baiyidao

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
没有破壁，在变行前另加点溶菌酶吧
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18楼2009-08-19 09:01:43
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恒星年

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我以前提细菌基因组的时候用的是自己配制的试剂，CTAB法 加蛋白酶K的方法，用NaCl沉淀。效果很好啊，做PCR没问题。
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19楼2009-08-19 09:11:19
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1） 吸取富集培养后纯菌菌液1.5 ml，8,000 rpm下离心3min，弃掉上清液，再加入1.5ml菌液同样条件下离心3min, 弃掉上清液，加入1ml TE缓冲液（pH8）洗涤，同样条件再次离心。
（2） 弃掉上清液后，加入300 l TE 缓冲液（pH8.0），重悬。
（3） 加溶菌酶15 l (20mg/ml)，37℃下温浴 1hr。
（4） 加10% SDS 50 l,轻摇匀，加蛋白酶K 5 l;加 TE缓冲液 （pH8）130l 至总体积 500 l，置于37℃ 1hr；期间轻摇3～4次。
（5） 加100 l 5M NaCl，轻摇匀，加80 l CTAB/NaCl，轻摇匀，65℃ 水浴10 min。
（6） 加等体积（700 l）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)，轻颠倒混匀抽提。
（7） 10,000 rpm 离心10 min，吸取上清到另一EP管中。
（8） 加等体积氯仿/异戊醇（24：1）轻颠倒混匀抽提，10,000 rpm离心 10 min，吸取上清到另一EP 管中。
（9） 加0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀，置于-20℃ 20～30min。
（10）12,000 rpm 离心20 min，倾去上清液。
（11）沉淀用1 ml 预冷 70%乙醇 颠倒洗涤，10,000 rpm 离心，倾去乙醇。
（12）沉淀在37℃下风干；风干后加40～50l TE 缓冲液（pH8.0）37℃溶解30～60 min 。置于-20℃保存。
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20楼2009-08-20 10:17:37
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