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wanzi

木虫 (正式写手)

安静的虫虫

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虫号: 653832
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专业: 管理心理学

[交流] 细菌基因组提取不出来

各位大虾好：
最近我提取芽孢杆菌基因组中出现了问题，不知怎么回事，求助各位大虾帮忙。
我的细菌是芽孢杆菌，用试剂盒提了好多次都没有提出基因组来，电泳没有条带，只有marker的条带，不知怎么回事，不知各位，有没有没碰到过这种情况，恳请各位不吝赐教！！多谢！

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1楼2009-08-18 10:35:44

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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

BioEPI: 1
应助: 29 (小学生)
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虫号: 462771
注册: 2007-11-19
性别: GG
专业: 微生物资源与分类学

★
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1）吸取富集培养后纯菌菌液1.5 ml，8,000 rpm下离心3min，弃掉上清液，再加入1.5ml菌液同样条件下离心3min, 弃掉上清液，加入1ml TE缓冲液（pH8）洗涤，同样条件再次离心。
（2）弃掉上清液后，加入300 l TE 缓冲液（pH8.0），重悬。
（3）加溶菌酶15 l (20mg/ml)，37℃下温浴 1hr。
（4）加10% SDS 50 l,轻摇匀，加蛋白酶K 5 l;加 TE缓冲液（pH8）130l 至总体积 500 l，置于37℃ 1hr；期间轻摇3～4次。
（5）加100 l 5M NaCl，轻摇匀，加80 l CTAB/NaCl，轻摇匀，65℃ 水浴10 min。
（6）加等体积（700 l）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)，轻颠倒混匀抽提。
（7） 10,000 rpm 离心10 min，吸取上清到另一EP管中。
（8）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）轻颠倒混匀抽提，10,000 rpm离心 10 min，吸取上清到另一EP 管中。
（9）加0.6倍体积的预冷异丙醇，混匀，置于-20℃ 20～30min。
（10）12,000 rpm 离心20 min，倾去上清液。
（11）沉淀用1 ml 预冷 70%乙醇颠倒洗涤，10,000 rpm 离心，倾去乙醇。
（12）沉淀在37℃下风干；风干后加40～50l TE 缓冲液（pH8.0）37℃溶解30～60 min 。置于-20℃保存。