应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（九）
361/1返回列表
查看: 1199  |  回复: 35
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

NanoFCMlxq

新虫 (正式写手)
已领完
外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（九）
领取红包 (小木虫手机app专属红包)

扫一扫，下载小木虫客户端

今天分享一篇发表在PLOS Biology（2021年IF=8.029）上的文章，名为《Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles》[1]（神经干细胞通过细胞外囊泡运输功能性线粒体）。

神经干细胞移植诱导中枢神经系统疾病动物模型的恢复。虽然替代丢失的内源性细胞最初被认为是神经干细胞移植物的主要恢复机制，但现在很清楚，移植的神经干细胞通过多种机制发挥作用，包括通过细胞外囊泡将治疗性物质横向交换给宿主细胞。细胞外囊泡是运输核酸、蛋白质、代谢物和代谢酶、脂质和整个细胞器的膜颗粒。然而，这些物质的功能和对神经干细胞广泛治疗效果的贡献还有待充分了解。线粒体功能障碍是几种炎症性和退行性中枢神经系统疾病的既定特征，其中大多数可以用外源性干细胞疗法治疗。在此，我们研究了神经干细胞通过内皮细胞释放和运输功能性线粒体以恢复靶细胞线粒体功能的假设。非靶向蛋白质组学显示，肠上皮细胞中神经干细胞自发释放的线粒体蛋白质显著富集。形态学和功能分析证实了EVs内存在超微结构完整的线粒体，具有保守的膜电位和呼吸。我们发现这些线粒体从EVs转移到mtDNA缺陷型L929 Rho0细胞挽救了线粒体功能，并且增加了Rho0细胞的存活率。此外，将来自EVs的线粒体掺入炎性单核吞噬细胞恢复了正常的线粒体动力学和细胞代谢，并降低了靶细胞中促炎性标记物的表达。当移植到多发性硬化动物模型中时，外源性神经干细胞主动将线粒体转移到单核吞噬细胞，并诱导临床缺陷的显著改善。我们的数据提供了第一个证据，表明神经干细胞通过内皮祖细胞向靶细胞递送功能性线粒体，为开发新的方法铺平了道路，该方法旨在恢复多发性硬化以及退行性神经疾病中的线粒体功能障碍。

研究过程：

一、细胞外囊泡和外泌体的蛋白质组学分析鉴定线粒体蛋白质

首先对全EV部分和蔗糖梯度纯化的外泌体进行了基于非靶向多重TMT的蛋白质组学分析，这些外泌体由神经干细胞在体外自发释放，并将其与亲代神经干细胞全细胞裂解物进行了比较。

使用基因本体细胞成分(GOCC)注释，研究与神经干细胞相比，富含EVs的蛋白质的亚细胞起源。发现带有指示外体定位的注释的蛋白质在EVs中显著富集，而带有指示核定位的注释的蛋白质则缺乏。有趣的是，与神经干细胞相比，带有线粒体定位注释的蛋白质在内皮细胞中也显著富集。

为了进一步研究后一个发现，接下来用特定的GOCC子注释检查了数据，表明定位于3个主要的线粒体结构成分：外膜、内膜和基质。与神经干细胞相比，具有这些注释的蛋白质在内皮细胞中相对富集。还特别检查了5个线粒体复合体亚单位的相对丰度，发现线粒体和核基因组中编码的线粒体蛋白质在EVs中都显著富集。然后研究了EVs的DNA含量，发现在mtDNA中编码的线粒体基因NADH脱氢酶亚基1(mt-ND1)存在于EVs中，而不管它们是否用DNase I预处理。然而，在核DNA中编码的线粒体基因琥珀酸脱氢酶复合物亚基D(Sdhd)并非如此，因此表明核DNA没有富集，而EVs中可能存在线粒体基质完整的线粒体。

为了进一步验证基于TMT的蛋白质组数据，接下来对EVs和NSCs进行免疫印迹分析。与NSCs相比，EVs富含外体标记物(CD9、Pdcd6ip和Tsg101)和线粒体复合物，但缺乏高尔基标记物(Golga2)。相反，从神经干细胞裂解物获得的富含线粒体的对照制剂(称为 Mito)被发现缺乏CD9并富含Golga2。

为了排除与纯化方法相关的任何潜在偏差，进一步采用了另外两种高质量和可大规模生产的商品化基于外泌体/EV沉淀的分离方案，避免了超速离心。我们发现，这些方案产生的EV缺乏Golga2，但富含CD9和线粒体蛋白。

由于已知这些基于沉淀的试剂盒中的大部分也可以同时分离非EV成分，我们随后试图使用两个附加方案进一步分析源自NSC的EV。首先，我们使用免疫介导的EV标记物CD63的分离试剂盒，从而获得富含CD63的EV部分(EVsCD63_enrich.)，和缺乏CD63的EV部分(EVsCD63_depl.)。我们发现线粒体复合蛋白在EVsCD63_enrich.中的表达最高，而对照培养基制剂中没有EV和线粒体复合物。其次，由于完整的线粒体通常在0.2-1um之间，我们测试了一种超速离心方案，该方案在EV分离的基础上增加了0.22um超滤步骤。我们发现，这个方案，用于排除完整的线粒体(以下简称EVsMito_depl.)，导致来自线粒体复合蛋白的信号强度显著降低。

接下来，我们将重点放在通过蔗糖梯度分离从EV制剂中分离的外体部分。与亲本神经干细胞相比，基于TMT的蛋白质组学分析的外泌体的总蛋白质组成与EVs相似。然而，与EVs相比，通过额外的纯化步骤，一些蛋白质在外体中选择性地缺失。与亲代神经干细胞相比，外泌体也显著富含蛋白质，GOCC注释表明定位于线粒体外膜、内膜和基质。免疫印迹分析证实，对应于预期外体密度(1.13-1.20g/ml)的级分6至9都富含线粒体复合蛋白。当观察单个片段的脱氧核糖核酸含量时，我们确认了其中有线粒体基因mt-ND1，但没有Sdhd基因，这明确证实了NSC外体以及EVs含有线粒体蛋白质和mtDNA。总之，这些数据表明，无论用于从组织培养基中分离囊泡的方案如何，线粒体蛋白都存在于EV中，这表明存在线粒体片段或由神经干细胞脱落的完整线粒体。

二、EV制剂中发现结构和功能完整的线粒体

使用互补的生物物理和形态学方法进一步鉴定神经干细胞EV的特征。使用可调电阻脉冲传感(TRPS)分析和纳米粒子跟踪分析(NTA)，发现EV的直径大约在80nm到150.8nm之间。通过基于透射电子显微镜(TEM)的形态学分析进一步研究尺寸分布，在平均直径为350.13nm(±25.70nm)的EVs异质性群体中，我们发现27.81% (±3.54)的颗粒对应于平均直径为695.4nm(±68.47nm)的线粒体样结构。这一发现与EV制剂中完整线粒体的存在是一致的。

接下来，通过纳米流式检测技术（nanoFCM）分析，比较了我们的EV制剂和EVsMito_depl.。发现在大小介于0.04-1um之间的总EVs中，有33.52% (Q2+Q3) 为MitoTracker red（线粒体染料）阳性。其中，77.6% (Q2/[Q2+Q3])也表达了标准EV标记CD63。相反，EVsMito_depl几乎完全没有 MitoTracker red阳性，很可能只包含线粒体蛋白质和/或片段。

接下来，我们使用冷冻-透射电镜结合免疫金标记(使用与金纳米颗粒(NP)结合的抗体)来识别EV内线粒体的存在。在我们所有的粗制EV制剂中都发现了TOMM20+游离线粒体，当 saponin被用作温和去污剂以增加抗体渗透性时，我们还鉴定出了具有3种不同膜的TOMM20和CD63双阳性颗粒。总之，这些方法证实了神经干细胞在体外自发释放亚微米范围的EVs，包括游离和包裹的线粒体。

最后，通过分别使用JC1测定法和高分辨率呼吸测定法(HRR)分析电子传递链(ETC)在维持线粒体跨膜电位和呼吸方面的活性，测试了粗制EV制剂中线粒体的功能。与EVsMito_depl相反，粗EV制剂显示出对线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)有反应的保守线粒体膜电位。此外，当线粒体复合物的底物加入到EV制剂中时，EV抑制了耗氧量。当使用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)测试线粒体呼吸链复合物的活性时，在自然条件下从EVs中分离出完整的蛋白质复合物。这一发现与CI-CII-CIV的保守催化活性相吻合，表明存在功能完整的线粒体复合物。

总之，这些发现表明，神经干细胞EVs具有功能性线粒体ETC和氧化磷酸化的潜力。

三、 EV相关的线粒体恢复了mtDNA缺乏细胞的营养缺陷

为了研究EVs是否对靶细胞有影响，我们首先准备表达线粒体MitoDsRed荧光报告子( MitoDsRed+NSCs)的NSCs，该报告子稳定地标记EVs中完整的线粒体。事实上，线粒体的线粒体靶序列保证了DsRed蛋白仅在那些保存完整膜的线粒体中积累，从而增强了该标志物的特异性。

然后，我们用 MitoDsRed+NSCs产生 MitoDsRed+ EVs，处理使用长期低剂量溴化乙锭导致mtDNA耗竭的细胞。这些 L929 Rho0细胞具有营养缺陷型生长和对细胞外尿苷的依赖性。

在尿苷缺乏的条件下，我们发现与用富含分离线粒体的制剂( MitoDsRed+Mito)处理的L929 rho 0细胞相比，L929 rho 0细胞在处理后24小时内有效地掺入了MitoDsRed+EVs。在处理后5天，虽然只有少数未经处理的L929 rho 0细胞存活于尿苷耗竭，但用MitoDsRed+EVs处理的L929 rho 0细胞显示出显著更高的存活率。最后，在处理后16天，我们能够对用MitoDsRed+EVs处理的L929 rho 0细胞的mt-ND3线粒体基因进行测序，这表明(外源性)EV衍生的mtDNA在靶细胞中的有效整合以及对其内在线粒体DNA功能障碍进行纠正。

这些结果表明EV相关的线粒体能与持续mtDNA耗竭的靶细胞整合并恢复线粒体功能。

四、 EV相关的线粒体整合到单核吞噬细胞的线粒体网络中

线粒体功能和免疫代谢指导单核吞噬细胞对炎症刺激的激活。我们最近的研究发现外源性神经干细胞移植物具有免疫调节功能，并抑制体内响应内源性代谢信号的促炎单核吞噬细胞的激活。因此，为了进一步了解EV在神经干细胞免疫调节中的作用，我们接下来研究了这些EV是否被运输到单核吞噬细胞，并在此过程中影响其功能。

骨髓来源的巨噬细胞通过被脂多糖(LPS)攻击，产生反应性促炎巨噬细胞(MφLPS)，然后用MitoDsRed+EVs或外泌体处理。与静息状态下的Mφ [61.23% ( ±2.15)]或外泌体刺激的Mφ[3.7%(±0.23)]相比，mφLPS在处理后6小时通过荧光活化细胞分选(FACS)分析显示更高的MitoDsRed+[97.17% ( ±0.20)]。这一发现表明线粒体的掺入依赖于Mφ激活状态，主要由原始EVs而不是外泌体部分介导。

接下来，通过共聚焦高分辨率旋转圆盘图像的共定位分析，研究了用EVs处理的Mφ中外源线粒体的细胞内情况。发现6.58% (±2.00)和10.14% (±2.85)的 MitoDsRed+线粒体分别与溶酶体(LAMP1)或过氧化物酶体(PMP70)标记物共定位。这些发现表明 MitoDsRed+线粒体向这些细胞区室的运输有限。相反，48.24% (±4.43)和17.75% (±3.56)的线粒体被发现附着或包含在宿主的线粒体网络中。

为了进一步解决外源线粒体融合和掺入Mφ内源性线粒体网络的可能性，我们首先使用分裂自缔合荧光蛋白(FPs)来检测EVs与Mφ线粒体的接触。用LPS刺激瞬时表达与线粒体蛋白TOMM20融合的sfcherry 211蛋白的Mφ(即MφsfCherry2,11)，并用来自瞬时表达sfcherry 2,1-10蛋白的NSCs的EVs(即EVssfCherry2,1–10)处理。sfCherry2 FP的荧光信号与MφLPSendogenous线粒体网络并列，表明EVs与宿主线粒体网络融合。然后进行了相关光电子显微镜(CLEM)实验，通过结合免疫荧光标记和高分辨率超微结构来研究颗粒掺入， MitoDsRed+信号与整合在宿主MφLPS线粒体网络中的超微结构确定的线粒体完全共域。

因此，表明大多数EV相关线粒体优先从促炎Mφ中的溶酶体和过氧化物酶体途径逃逸，而与内源性线粒体网络共定位和融合。

结果就展示这么多，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，或者私聊我要文献资料，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Peruzzotti-Jametti, L; Bernstock, JD; Willis, CM; et al.Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles.[J].PLoS Biol.2021,19(4):e3001166

外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（九）


外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（九）-1


外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（九）-2


外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（九）-3


外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（九）-4


外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（九）-5


发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼2021-07-22 16:34:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1551195

银虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
外泌体纯化，加我15511958250

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
36楼2022-02-13 14:22:54
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
tzynew2楼
2021-07-22 16:35   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫Android客户端
发现病毒3楼
2021-07-22 16:35   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫Android客户端
Jzhang2134楼
2021-07-22 16:36   回复  
NanoFCMlxq(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
秋土豆香5楼
2021-07-22 16:37   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫Android客户端
melancolie6楼
2021-07-22 16:43   回复  
NanoFCMlxq(金币+2): 谢谢参与
已获得2个金币 发自小木虫Android客户端
json_seo7楼
2021-07-22 16:46   回复  
NanoFCMlxq(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
widegooseA8楼
2021-07-22 17:19   回复  
NanoFCMlxq(金币+5): 谢谢参与
已获得5个金币 发自小木虫Android客户端
Muqiao慕桥9楼
2021-07-22 17:28   回复  
NanoFCMlxq(金币+4): 谢谢参与
已获得4个金币 发自小木虫Android客户端
leafmavis10楼
2021-07-22 17:30   回复  
NanoFCMlxq(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
冰片11楼
2021-07-22 17:32   回复  
NanoFCMlxq(金币+5): 谢谢参与
已获得5个金币 发自小木虫IOS客户端
云在青天12楼
2021-07-22 18:02   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫Android客户端
yuying042113楼
2021-07-22 18:34   回复  
NanoFCMlxq(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
分子克隆12314楼
2021-07-22 18:44   回复  
NanoFCMlxq(金币+4): 谢谢参与
已获得4个金币 发自小木虫Android客户端
vkv08650915楼
2021-07-22 19:02   回复  
NanoFCMlxq(金币+2): 谢谢参与
已获得2个金币 发自小木虫IOS客户端
crb50977216楼
2021-07-22 19:02   回复  
NanoFCMlxq(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
ouq26849917楼
2021-07-22 19:02   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫IOS客户端
crr09758018楼
2021-07-22 19:03   回复  
NanoFCMlxq(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
韶敏白萱19楼
2021-07-22 19:08   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫IOS客户端
红香灵凡20楼
2021-07-22 19:11   回复  
NanoFCMlxq(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
凡灵和悦21楼
2021-07-22 19:12   回复  
NanoFCMlxq(金币+5): 谢谢参与
已获得5个金币 发自小木虫IOS客户端
兴德丹云22楼
2021-07-22 19:17   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫IOS客户端
齐心雨伯23楼
2021-07-22 19:20   回复  
NanoFCMlxq(金币+4): 谢谢参与
已获得4个金币 发自小木虫IOS客户端
津童翰池24楼
2021-07-22 19:21   回复  
NanoFCMlxq(金币+5): 谢谢参与
已获得5个金币 发自小木虫IOS客户端
梓璐苇然25楼
2021-07-22 19:25   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫IOS客户端
俊茂秀兰26楼
2021-07-22 19:27   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫IOS客户端
思菱红p27楼
2021-07-22 19:27   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫IOS客户端
寻巧靖之28楼
2021-07-22 19:30   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫IOS客户端
妞思茵x29楼
2021-07-22 19:31   回复  
NanoFCMlxq(金币+5): 谢谢参与
已获得5个金币 发自小木虫IOS客户端
代灵觅晴30楼
2021-07-22 19:34   回复  
NanoFCMlxq(金币+4): 谢谢参与
已获得4个金币 发自小木虫IOS客户端
欣语儿f31楼
2021-07-22 19:36   回复  
NanoFCMlxq(金币+4): 谢谢参与
已获得4个金币 发自小木虫IOS客户端
婉慧寄云32楼
2021-07-22 19:37   回复  
NanoFCMlxq(金币+2): 谢谢参与
已获得2个金币 发自小木虫IOS客户端
晴曦洋d33楼
2021-07-22 19:40   回复  
NanoFCMlxq(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫IOS客户端
白凡施然34楼
2021-07-22 19:42   回复  
NanoFCMlxq(金币+5): 谢谢参与
已获得5个金币 发自小木虫IOS客户端
书仪骊媛35楼
2021-07-22 19:42   回复  
NanoFCMlxq(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
相关版块跳转 我要订阅楼主 NanoFCMlxq 的主题更新
361/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件) 论文翻译-EnPapers美助理教授团队-SCI英文润色
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 申请基金代表性成果 +10 lancet0903 2024-05-17 10/500 2024-05-17 21:02 by lch2012
[基金申请] 南林海归博士首聘期 没拿到国自然，被降级后自杀 +32 babu2015 2024-05-13 34/1700 2024-05-17 18:52 by 清晨和风一起
[论文投稿] 当前scientific reports还值得投稿么？ +5 lizhengke06 2024-05-14 6/300 2024-05-17 18:28 by dxcharlary
[考博] 想被211以上高校课题组接收 +7 风起沧澜 2024-05-16 9/450 2024-05-17 16:39 by zhaojiang427
[论文投稿] 投稿成功后又想撤回 +5 otani 2024-05-16 5/250 2024-05-17 16:02 by topedit
[硕博家园] 民办高校入职后稳定吗？ +7 905452934 2024-05-16 12/600 2024-05-17 15:31 by xmc_ues_2015
[电化学] 常用的国产电化学工作站有哪些？ +7 123明湘 2024-05-11 7/350 2024-05-17 13:40 by FuMmm
[硕博家园] 领养小孩 +15 Yyds55 2024-05-14 15/750 2024-05-17 09:53 by 田园1983
[考博] 申博 +3 己醛糖 2024-05-11 4/200 2024-05-17 07:33 by 化研迅
[基金申请] 国自然青基把共同第一作者标成了唯一第一作者 +26 1137025804 2024-05-15 28/1400 2024-05-16 22:26 by 1135482512
[基金申请] 12个本子最多让给1a2b +16 地球e村长 2024-05-13 19/950 2024-05-16 17:48 by sars518
[硕博家园] 被导师抓着一个褥羊毛该咋办 +10 未来可期简直不� 2024-05-15 22/1100 2024-05-16 17:33 by 卓尔me
[教师之家] 加上“青年”两个字，意义就变了 +10 zylfront 2024-05-13 13/650 2024-05-15 23:36 by flasheagle
[基金申请] 有人看了我的科研之友 +9 jurkat.1640 2024-05-14 12/600 2024-05-15 16:04 by arthas_007
[基金申请] 评审规则突发奇想 +18 平凡冰雪花 2024-05-13 23/1150 2024-05-15 15:54 by 平凡冰雪花
[硕博家园] 博导推荐，申博，博士招生 +5 大林挺好 2024-05-13 6/300 2024-05-15 14:51 by zxl_1105
[论文投稿] 第一次投SCI，一审给了Revise +5 慎独的小花卷 2024-05-13 12/600 2024-05-14 20:58 by 慎独的小花卷
[论文投稿] 七个月了，还在selecting for review +3 g9522 2024-05-14 6/300 2024-05-14 19:00 by lizhengke06
[考博] 韩国成均馆大学 软物质杂化材料研究室 Koo Chong Min 教授课题组 诚招博士生 +5 NWPUGZG 2024-05-13 9/450 2024-05-13 16:40 by NWPUGZG
[基金申请] NSFC函评几月几日截止提交评审意见？ +9 瞬息宇宙 2024-05-11 9/450 2024-05-12 19:53 by 20081002
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭