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【文献精读】|一项胰腺导管癌的单细胞分析研究
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英文题目：Single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma identifies a novel fibroblast subtype associated with poor prognosis but better immunotherapy response 中文题目：胰腺导管癌的单细胞分析确定了一种与预后不良相关但免疫治疗反应更好的新型成纤维细胞亚型 期刊：cell discovery 2021实时影响因子（Real-Time IF）：12.2 发表时间：2021.5.25 文章摘要 目前胰腺导管癌 (PDAC) 的病理和分子分类为治疗选择提供了有限的指导，尤其是免疫治疗。癌症相关成纤维细胞 (CAF) 是 PDAC 中促结缔组织基质的主要参与者，调节肿瘤进展和治疗反应。使用scRNA-seq，研究探讨了不同程度结缔组织增生的 PDAC 患者的肿瘤间异质性。 研究发现 CAFs、导管癌细胞和免疫细胞在极致密和松散类型的 PDAC（致密型：结缔组织增生程度高；松散型：结缔组织增生程度低）之间存在显着的肿瘤间异质性。值得注意的是，两者间未检测到 CAF 丰度的差异，但与密集型 PDAC 相比，在松散型 PDAC 中发现了一种具有高度活化代谢状态的新型 CAF 亚型 (meCAF)。 MeCAFs 具有高度活跃的糖酵解，而相应的癌细胞使用氧化磷酸化作为主要代谢模式而不是糖酵解。研究发现松散型 PDAC 中免疫细胞的比例和活性远高于密集型 PDAC。然后，在研究的 PDAC 队列和公共数据库中进一步验证了 CAF 亚型的临床意义。具有丰富 meCAFs 的 PDAC 患者具有较高的转移风险和较差的预后，但对免疫治疗的反应明显更好（客观反应率为 64.71%，1 例PR）。 本研究表征了致密型和松散型 PDAC 之间细胞成分、免疫活性和代谢状态的肿瘤间异质性，并将 meCAF 鉴定为对 PDAC 进展和对免疫治疗的敏感性至关重要的新型 CAF 亚型。 01 研究背景 PDAC 仍然是最致命的恶性肿瘤之一，5 年生存率约为 8%。 80% 的 PDAC 在诊断时无法切除，因此大多数 PDAC 患者依赖全身治疗。然而，一线PDAC化疗（白蛋白结合型紫杉醇联合吉西他滨）的客观缓解率（ORR）仅为~20%。然而，根据之前的报告，PDAC 患者对 PD-1 抗体仍然没有反应或反应不佳，主要是由于其“免疫冷”特征，肿瘤内 CD8+ T 细胞非常少。致密的细胞外基质 (ECM) 作为物理屏障和基质细胞最终抑制自发和治疗诱导的抗肿瘤免疫，导致 PDAC 中的“冷免疫”微环境。然而，尚未在未经选择的 PDAC 患者中观察到可接受的临床疗效。因此，免疫治疗的一个挑战将是发现合理的生物标志物来选择易感患者进行免疫治疗。 目前仍然缺乏用于选择易感 PDAC 人群进行免疫治疗的敏感标记物。具有致密基质（高结缔组织增生）的 PDAC 中的 CAF 会产生物理屏障，这可能导致对免疫疗法的反应不佳，而具有松散基质（低结缔组织增生）的 PDAC 在组织病理学分析中似乎具有较少的物理屏障，并且可能具有潜在的免疫治疗的机会。然而，具有不同程度结缔组织增生的PDACs对免疫治疗的反应及其潜在机制尚不清楚。在本研究中，通过单细胞转录组测序（scRNA-seq）研究了不同程度的结缔组织增生（致密型、高结缔组织增生；松散型、低结缔组织增生）患者的肿瘤间异质性及其对预后和治疗反应的影响。 02 研究结果 2.1 单细胞转录组分析揭示了人类的密集型和松散型 PDAC 之间的肿瘤间异质性 人类 PDAC 的标志是由 CAFs 引起的广泛的结缔组织增生。以前根据组织学特征对致密型和松散型 PDAC 进行分类，但没有分子生物标志物表明它们在预后和治疗选择方面的潜在差异。为了探索 PDAC 中不同质地的肿瘤间异质性，本研究首先根据肿瘤组织病理学（Haemo toxylin 和 Eosin；H&E 和 Masson 染色）将 PDAC 分为致密型和松散型。来自未经治疗的 PDAC 患者的九个肿瘤，包括四个致密型 PDAC、三个松散型 PDAC 、两个中型 PDAC（在致密型和松散型 PDAC 之间）以及一个相邻的正常样本，被酶消化成单细胞悬液，然后使用 10x Genomic 平台进行单细胞测序（图 1a，b）。 为了提高分析能力，所有十个样本的数据与公共数据（包括四个公共 PDAC 样本和两个正常胰腺样本）相结合。在质量控制和去除低质量细胞后，总共保留了 77,121 个细胞（研究的 38,831 个细胞以及来自公共数据的 38,290 个细胞）用于下游分析。观察并校正了样品之间的批次效应。基于UMAP图的细胞聚类确定了20个细胞簇，每个簇中具有统一的Marker基因，与文献中细胞群的已知Marker交叉引用，并用于注释不同的细胞类型（图 1c）。表征了八种主要细胞类型：导管细胞、腺泡细胞、内分泌细胞、内皮细胞、B 细胞、T 细胞、成纤维细胞和单核细胞/巨噬细胞（图 1d）。研究令人惊讶的是，两种类型的 PDAC 之间的 CAF 比例相当。然而，松散型 PDAC 中免疫细胞（包括 T 细胞和单核细胞/巨噬细胞）的比例远高于致密型 PDAC（图 1c）。然后使用免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色来确认致密型和松散型 PDAC 中不同细胞类型的比例变化。研究对scRNA-Seq 的九个 PDAC 样本进行了多重染色，结果显示松散的基质与浸润性 T 细胞和巨噬细胞的增加有关（图 1e）。因此，这些结果表明致密型和松散型人类 PDAC 中基质细胞成分的异质性。   图1.单细胞分析揭示了人类的密集型和松散型 PDAC 之间的肿瘤间异质性 2.2在松散型 PDAC 中鉴定了 meCAF 为了表征 PDAC 中的 CAF 亚群，研究进行了无监督聚类分析，研究表明被分类为星状和成纤维细胞样 CAF 的 CAF 可以根据其Marker进一步分为六个亚群基因。星状 CAF 分为两个亚群，C1（通过标记基因 RGS5 和 CD36）和 C2（通过标记基因 MT1M 和 TAGLN），而成纤维细胞样 CAF 分为四个亚群（C0、C3、C4 和 C5） （图 2a、b）。根据以前的研究知道亚群 C3 是 myCAFs，它高度表达 COL10A1 和 POSTN，其标记基因与 ECM（extracellular matrix，细胞外基质） 受体相互作用和 PI3K/AKT 信号传导相关（图 2a、c）。亚群 C0 与 iCAF 相似，因为 C0 中的标记基因参与炎症途径，如补体级联、细胞因子介导的信号传导和细胞趋化途径（图 2c）。亚簇C5没有典型的标记基因，CD74和HLA-DRA的表达略有增加，表明其潜在的弱抗原呈递功能。最有趣的是，研究发现了一个新的亚簇 C4，其特征是 PLA2G2A 和 CRABP2 的高表达，其标记基因与翻译、线粒体翻译延伸和糖酵解有关，因此 C4 被命名为 meCAFs（图 2a、c)。 为了进一步确认 PDAC 中 meCAF、myCAF 和 iCAF 的存在，研究对进行 scRNA-seq 的九个 PDAC 样本的三种 CAF 亚群的标记基因进行了多重 IF 染色（C0 iCAF 为 APOD，橙色；C3 myCAF 为 POSTN，红色；C4 meCAF 为 PLA2G2A，绿色）。如图 2d 所示，在 PDAC 样品上观察到的重叠信号很少，表明 PDAC 的肿瘤微环境（TME）中存在三个不同的 CAF 亚群（图 2d）。胰腺星状细胞 (PSC) 被认为是 PDAC 中 CAF 的主要前体。值得注意的是，C4 亚群是松散型 PDAC 中的主要 CAF 种群，而 C3 是密集型 PDAC 中的主要亚群（P = 0.032）（图 2e）。为了进一步证实研究的发现，研究对所有进行scRNA-seq的九个样本进行了 IF 染色。来自密集型和松散型 PDAC 的代表性图像如图 2f 所示（图 2f）。 IF结果显示POSTN在致密型PDAC的基质中高表达，而PLA2G2A在松散型PDAC的基质中高表达，这与研究的scRNA-seq分析结果一致（P = 0.034）（图2g） ）。   图2. 松散型和密集型 PDAC 之间的不同 CAF 亚群占比 2.3 癌细胞和 CAF 之间的细胞交流决定了致密型和松散型 PDAC之间不同的微环境 CAF 异质性受到来自不同肿瘤细胞的信号的空间调节。已有研究表明，肿瘤细胞内在的 TGFβ 和 IL-1/JAK/STAT3 信号传导是造成 myCAF 和 iCAF 形成的主要途径。为了阐明 meCAFs 的形成，研究发现了致密型和松散型 PDACs 之间导管癌细胞的瘤间异质性。在本研究中，导管癌细胞聚集成四个主要群体（C2、C6、C10、C19）（图 3a）。通过比较两种类型的 PDAC 肿瘤，研究发现 C6 亚群在密集型 PDAC 中占优势，而 C2 亚群在松散型 PDAC 中占优势（图 3b）。值得注意的是，C2 亚群表达经典Marker基因，如 TFF1、LYZ、TMASF1 和 LAMB3，而 C6 亚群表达基因，如 DMNK、LDHB、HPGD 和 MYLC。标记基因的 GO 和 KEGG 分析表明，导管癌细胞 C6 亚群中高表达的基因参与糖酵解、氨基酸的生物合成、HIF-1α 信号传导、ECM 结合和上皮细胞分化。相比之下，C2 亚群显示出富含氧化磷酸化、ECM 分解、I 型干扰素信号传导、抗原呈递和白细胞跨内皮迁移的基因（图 3c、d）。这些数据揭示了 C2 和 C6 亚簇的独特代谢特征，这可能与其在肿瘤中的不同位置和周围 TME 相关。 此外，本研究发现在 C2 亚群中表达的基因具有炎症特征，包括参与促进免疫细胞运输和抗原呈递以及激活干扰素信号传导的基因。该结果与研究的发现一致，即松散型 PDAC 中 T 细胞和单核细胞/巨噬细胞群的比例显着增加（图 1e）。为了阐明密集型和松散型 PDAC 之间的 T 细胞异质性，研究对泛 T 细胞群进行了无监督的降维和聚类。 T 细胞可以在 PDAC 中重新组合成八个不同的亚群（图 3e）。密集型和松散型 PDAC 中每个 T 细胞亚群的比例如图 3f 所示。值得注意的是，CD8+ T 细胞组在所有 T 细胞中的比例在松散型 PDAC 中显着增加（P = 0.034）（图 3f）。然后通过IF染色进一步证实结果。在进行 scRNA-seq 的 9 个 PDAC 样本中进行了多重 IF 染色，结果显示松散型 PDAC 中的 CD8+ T 细胞浸润比致密型 PDAC 多得多（P = 0.034）（图 3h，i）。此外，GSEA 结果显示，与致密型 PDAC 相比，松散型 PDAC 中 CD8+ 激活的 T 细胞中的多胺代谢、PD-1 信号转导、线粒体翻译、IFNγ 信号转导和抗原加工途径增强（图 3g）。这些数据表明，松散型 PDAC 中的 CD8+ T 细胞不仅显示出增加的比例，而且还具有增强的细胞毒性能力。与 CD8+T 细胞的结果相似，研究还观察到包括抗原呈递、溶酶体、多胺代谢、PPAR 信号和 NF-κB 信号等功能在来自松散型 PDAC 的单核细胞/巨噬细胞中显着富集，表明其炎性特征（图 3j）。   图3. 致密型和松散型 PDAC 中导管细胞和免疫细胞的不同特征 2.4 具有 meCAFs 的松散型 PDACs患者显示出更差的预后 由于以上研究定义的致密型和松散型 PDAC 的肿瘤间异质性，假设这种差异可能会影响患者的预后和对治疗的反应。致密型 PDAC 具有适应 TME 的能力，其特点是缺氧和供血不足，因此，该亚型可能对化疗的敏感性低于其他类型 。富含基质的 TME 降低了转移/侵袭能力并减少了免疫细胞对肿瘤细胞的反应；因此，这种类型可以被认为是一种相对“冷免疫”的肿瘤。相比之下，由于基质限制较少，松散型 PDACs 具有相对较高的侵袭和转移能力，并且比致密型 PDACs 具有更多的浸润免疫细胞；因此，这种类型被认为是“热免疫”肿瘤。 为了验证研究的假设，研究首先随访了被招募的 7 名进行 scRNA-seq 研究的患者（3 名松散型 PDAC 患者和 4 名密集型 PDAC 患者）。与研究的假设一致，所有三名松散型 PDAC 患者在手术后 6 个月内复发。此外，研究使用 TCGA 数据库分析了多个 CAF 亚组中标记基因与患者预后的关联。研究发现 meCAF 的组合标记基因表达系数与患者存活率呈负相关（图 4a）。此外，为了验证上述六个 CAF 亚组标记基因的表达，研究对每个亚簇（C4 meCAFs 为 PLA2G2A 和 CRABP2，C3 myCAFs 为 POSTN，C0 iCAFs 为 APOD，C1 为 RGS5，C2为 MYH11 ）的PDAC患者队列（Renji 队列，n = 94）进行生存分析。生存分析结果表明，基质中 meCAF 标志物（PLA2G2A + CRABP2）的高表达与较差的总生存期有关（HR：3.900，95% CI：2.134-7.127）（图 4b）。并且与临床病理学特征的相关性分析表明，meCAFs 与患者的血管浸润呈正相关。然而，未发现其他四个 CAF 亚组与总生存期相关。这些数据进一步表明，meCAFs 可能与 PDAC 较高的转移潜力有关，从而影响患者的预后。  图4. 基质中 meCAF 标志物的高表达预示着 PDAC 患者的预后不良 2.5 高丰度的 meCAFs 与 PDAC 患者对免疫治疗的更好反应相关 在临床实践中，经常遇到具有中度结缔组织增生的 PDAC，它具有致密和松散型 PDAC 基质的部分特征。很难将这些情况分为密集型或松散型 PDAC。因此，与结缔组织增生程度相比，meCAF信号可以被精确量化，并可能用于预测PDAC患者的预后及其对免疫治疗的反应。为了探索 meCAF 丰度是否会影响对免疫疗法的反应，又进行了一项初步研究，以观察患者对 PD-1 抗体的反应。通过使用经皮活检明确病理诊断为转移性 PDAC 的年龄≥18 岁的患者符合条件。接受过先前系统治疗（包括辅助治疗）的患者被排除在外。先用H&E染色区分肿瘤间质，然后用 IF 染色检测PLA2G2A的表达。选择了 17 名具有丰富 meCAFs（基质中高 PLA2G2A 表达）的 PDAC 患者，并评估了他们对 PD-1 抗体的反应。详细的临床信息如图 5a 所示。这些患者首先接受了6个周期的化疗（白蛋白结合型紫杉醇联合吉西他滨）联合PD-1抗体，然后单独接受PD-1抗体作为维持治疗。研究发现，在这 17 名患者中观察到了显着的反应（10 人部分缓解，1 人完全缓解，ORR：64.71%），远高于之前的报告（图 5b)。值得注意的是，获得 CR 的患者接受了 PD-1 抗体作为维持治疗（> 3 个月），评估结果仍为 CR（图 5c）。这些数据鼓励后期进行大规模的临床研究，以进一步验证发现的临床意义。 本研究并未观察到基因突变与这两种 PDAC 之间的任何关系。因此提出了一个假设，即与密集型 PDAC 相比，松散型 PDAC 可能在表观遗传修饰而不是基因组改变方面存在差异。研究总结了致密型和松散型 PDAC 中细胞成分、功能和代谢的肿瘤间异质性，表明了潜在的临床意义和治疗策略，myCAFs 和 meCAFs 以两种不同的方式促进 PDAC 的发展：myCAFs 通过近分泌机制产生 ECM 并通过物理屏障阻断免疫细胞浸润来促进 PDAC 的生长，而 meCAFs 产生代谢中间体作为燃料成为癌细胞和免疫细胞的来源以促进 PDAC 进展（图 5d）。   图5. 高丰度的 meCAFs 与 PDAC 患者对免疫治疗的更好反应相关 03 研究意义 该研究表征了致密型和松散型 PDAC 之间细胞成分、免疫活性和代谢状态的肿瘤间异质性，并将 meCAF 鉴定为对 PDAC 进展和对免疫治疗的敏感性至关重要的新型 CAF 亚型，表明了潜在的临床意义和治疗策略。 |
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