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abcjlm铜虫 (小有名气)
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因镍柱都是有载量的，如果用低于目的蛋白的含量载量的镍柱体积对目的蛋白的纯度有提高吗？相对使用高于目的蛋白含量的镍柱体积 一直好奇这个问题，然而又没办法实践，我想的是杂蛋白的吸附能力应该没有目的蛋白强，就像咪唑洗脱一样，有人跟我说因为你使用的体系是一样的，一直是同样浓度挂柱的，是不会有作用的，可我想的是流穿不是目的蛋白的含量很低吗？后来挂不上柱子的目的蛋白浓度不是越来越高吗？然后同事说那和用低浓度咪唑洗有什么区别，我是一直绕不过来，有什么好的解释吗？ |
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fuyuandj86
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2楼2021-06-23 13:38:24
原海亮
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【答案】应助回帖
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abcjlm(fuyuandj86代发): 金币+3 2021-07-03 14:45:35
感谢参与，应助指数 +1
abcjlm(fuyuandj86代发): 金币+3 2021-07-03 14:45:35
本来似乎大概明白你的问题了，然后又被你的描述绕的晕晕乎乎 你可能是想知道柱子过载和未饱和两种方式对最终产品的纯度的影响。 首先，这样的对比实验为什么是没有办法实践的呢？在我们第一次使用镍柱的时候，根据说明书可以计算一个的理论挂载量，但实验中的实际挂载量还是要在第一次摸索条件时候进行确定，即你要一直上样直至饱和过载后，流穿液中目的蛋白开始增加，证明柱子吸附目的蛋白的量已经基本饱和。这个摸索最大载量的过程，其实就可以作为你验证过载与未过载的一个对比实验。 其次，如楼上所述，镍柱未饱和情况下，是会有个别杂蛋白结合，但结合量有限，因为杂蛋白与目的蛋白结合能力的差异，在杂蛋白结合同时伴随着你目的蛋白也在大量结合的，这样相对来讲，这个杂蛋白的增加对后续影响不大。重要的是你的洗脱条件，挂柱过程中增加的杂蛋白基本上在后续合适的洗脱条件下就被分离了，这个杂蛋白的增量，对你大量结合的目的蛋白的纯度影响不大。 最后，如果从生产成本和产品收率来讲，应该充分的利用镍柱的挂载量，而上样量也应接近柱挂载量为适。对产品纯度的影响最重要的是目的蛋白的性质及洗脱条件的摸索，不太理解你说的“可我想的是流穿不是目的蛋白的含量很低吗？后来挂不上柱子的目的蛋白浓度不是越来越高吗？”，如果住子未饱和，那么流穿液里目的蛋白含量是很低甚至没有，但是挂不上柱子流穿的蛋白浓度，最多不是和柱前液浓度相当么，你是和那个样品对比，目的蛋白越来越高了？ |
3楼2021-06-24 09:17:12
4楼2021-06-24 11:42:10
walking dead
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5楼2021-06-25 08:47:13
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
abcjlm(fuyuandj86代发): 金币+3 2021-07-03 14:46:23
abcjlm(fuyuandj86代发): 金币+3 2021-07-03 14:46:23
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上样量及柱体积的变化对杂蛋白的量会有一些影响，但是样品里面杂蛋白的种类不会改变，挂的杂蛋白多了，同时目的蛋白的量也相应的多，两者的比例不会变化太多，这样可能会导致后面洗脱的时候，洗脱的次数与体积增加，对纯度的影响效果被逐步的稀释减弱。 从成本和收率角度讲，我们肯定希望不浪费物料的同时，充分利用柱子的载量，最大化的发挥其纯化产能。 蛋白亲和层析，和蛋白种类及发酵系统都有关系，有的蛋白一步亲和即可获得单一的目的蛋白，而有的蛋白则需要增加其他的纯化工序，离子、分子筛、疏水、膜系统等都是可以选择的技术手段。 |
6楼2021-06-25 10:46:20