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[求助]
线粒体自噬指示工具-mt-Keima质粒DMSO和自噬诱导组完全拍摄不到绿色荧光，求助！
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求助！ 问题背景是：我们实验室从别的实验室要了mt-Keima的质粒（mt-keima在线粒体自噬发生的时候(pH=4)，激发光在561左右nm发出来的光为红色，在静息状态下(pH=4)，激发光在458nm左右呈绿色），但是我两次瞬转293，无论DMSO还是线粒体自噬诱导剂CCCP处理均只能拍到红色荧光，而绿色荧光拍不到，用的是蔡司的共聚焦显微镜。第一次做的时候用458nm和561nm的激发光，发射光信号采集范围由软件本身smart setup决定，拍摄不到绿色荧光；第二次做的时候询问了赠予我们质粒的实验室的一个师兄，他说都用561nm的激发光，绿色和红色信号选择采集发射光范围不同即可，同时他们用的是徕卡的共聚焦，需要用到between frame模式。 我的问题是：1，看了些应用mt-Keima的文献，绿色和红色分别用的是不同的激发光，我用同一个激发光拍出来的，红色和绿色信号完全重叠，所以一个激发光完全行不通呀，到底应该选择什么激发光？detection的波长采集区域需要设置为多少范围呢？ 2. between frame 在蔡司的共聚焦上有吗，这个功能我百度了之后我觉得对于我拍照的影响不打，觉得不相关。这个功能可能对我的实验有影响吗？ 3. 关于mt-keima质粒本身，是不是这个质粒就可能有问题，这个质粒按照赠予我们质粒的实验室发表文章中引用的一篇参考文献来看（PMID:21867919）需要提前一天用ponasteronae A处理以诱导mt-Keima的表达，但其他文献中均没有看到这个说法例如在PMID:28703790中。 所以求助各位大佬们，拜托帮我想想问题出在哪了，为什么我拍不出来绿色荧光信号呢？下面的两张图是通过手机在目镜上拍的，但是共聚焦就拍不出来，且下面的图片是我DMSO组，按理说不应有红色信号。  微信图片_20210619144423.jpg  微信图片_20210619144429.jpg |
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