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NanoFCMlxq

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纳米材料相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（二）
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今天分享一篇发表在Nature Communications（2020年IF=12.121）上的文章，名为《Immunomodulating nano-adaptors potentiate antibody-based cancer immunotherapy》[1]（免疫调节纳米适配器增强基于抗体的癌症免疫治疗）。

目前在临床中促进癌症免疫治疗的策略包括两大类，一类是利用免疫调节单克隆抗体(mAbs)使功能失调的T淋巴细胞恢复活力。阻断细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1 (PD1)和程序性细胞死亡配体1 (PDL1)的单克隆抗体是癌症免疫治疗的主要方式，近年来已经彻底改变了癌症治疗模式。值得注意的是，大量能够增强先天免疫细胞(例如自然杀伤细胞和巨噬细胞)的抗肿瘤活性的单克隆抗体也正在研究中。

另一种策略是通过嵌合抗原受体(CAR) T细胞或双特异性T细胞接触抗体(BiTEs)促进效应免疫细胞和肿瘤细胞的接触。前者是表达识别特异性肿瘤相关抗原(TAA)的人工受体的工程自体T细胞，后者是双特异性抗体(bsAbs)的高级形式，它包含能同时与T细胞受体复合物和TAA结合的双变量片段。尽管抗癌机制不同，CAR-T细胞和BiTE有一个共同的特点，即触发效应细胞和肿瘤细胞之间的物理连接，促进对后者的细胞毒性。

为了充分发挥这两种策略的优势，免疫调节单克隆抗体与CAR-T细胞或BiTEs联合使用，其效果优于单独使用。然而，这两种疗法在大多数情况下是独立工作的。我们推测，将这两种策略的特点整合到一个系统中，可能会进一步促进免疫治疗。我们提出，纳米颗粒固定两种靶向效应细胞和肿瘤细胞的单克隆抗体这样的系统，作为免疫调节纳米适配器(imNAs)，该工程制剂可能具有两个独特的特点。首先，固定化亲本单克隆抗体保持了它们的免疫调节特性，其次，由于它们的多价性，它们对两种细胞上的抗原都有很强的亲和力，并可以像“适配器”一样将它们连接在一起。我们预测，imNAs可以通过两种类型的单克隆抗体的混合实现扩增和无法实现的抗肿瘤作用。至于固定到纳米颗粒的方法，之前报道的方法主要依赖于化学反应。然而，这个过程很难控制，由于mAbs和纳米颗粒的高分子量，可能损伤mAbs的效价，限制临床转化。

本研究考虑到所有IgG抗体中的Fc区域都是相同或保守的，而且抗IgG (Fc特异性)抗体(αFc)可以通过非共价相互作用特异地识别和结合包含Fc片段的任何单克隆抗体，通过将αFc偶联到纳米颗粒表面(αFc- NP)，我们建立了一个多功能的抗体固定化平台(图1a)。我们证实，αFc-NP在温和混合形成imNAs后，可以方便有效地固定两种单克隆抗体，而不影响亲本单克隆抗体的抗原结合能力(图1b)。我们进一步选择了免疫检查点抑制剂αPD1(一种抗pdl1抗体)和αPDL1(一种抗pdl1抗体)作为模型单抗，表明imNAαPD1&αPDL1可以有效促进T细胞/肿瘤细胞的相互作用，与可溶性或纳米颗粒固定αPD1和αPDL1的组合相比，显著增强T细胞介导的抗肿瘤免疫。值得注意的是，在多种小鼠肿瘤模型中，在自然杀伤细胞和巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫反应中，imNAs相对于亲本单克隆抗体混合物的优势得到了验证(图1c)。总之，我们为imNAs的工程提供了一种方便、可控的方法，该方法的简单性、通用性和有效性使imNAs成为临床转化的一个有吸引力的候选方法。

研究过程：

一、 αFc氧化和αFc共价结合

将1 mg/mL的 αFc 在 50 mM acetate buffer (pH 4.2)（含10 mM NaIO4)中4°C溶解2h，这一步是氧化αFc上的Fc端的糖残基；氧化αFc的恢复，使用 Amicon? Ultra Centrifugal Filters (MWCO 100 kDa, Merck Millipore)(9000×g离心5分钟)。醛的生成由 Purpald?(4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4triazole, Sigma)检测。将0.1mg/mL氧化的αFc与胺化NP按预定的质量比混合，伯胺与醛基在4℃下温和搅拌反应12 h。最后，将硼氢化钠(NaBH4, Energy Chemical)加入混合物中，再孵育45分钟，以还原希夫碱中间体，并在NP和αFc之间生成稳定的共价键。离心收集制备的αFc- NP，上清中未结合的αFc用ELISA (goat IgG ELISA Kit, Alpha Diagnostic International)和超高效液相色谱(UPLC)检测。αFc的结合效果(BE)计算公式如下:BE= (A-B)/A，其中A为αFc的投料量，B为上清液中的αFc。

测量粒径分布，将NP和αFc-NP用5%葡萄糖溶液(1 mg/mL)稀释，使用Zetasizer Nano ZS(Malvern)进行表征。形貌检测，将NP和αFc-NP滴铸在硅片上，并用场发射扫描电子显微镜(Merlin Compact)对其进行成像。

二、 αFc-NP/单抗的构建与表征

αPD1与αFc-NP以αPD1/αFc比1:1 (w/w)混合，4℃孵育12 h，用Zetasizer Nano ZS检测αFc-NP αPD1的直径。为了确认αPD1通过FC特异性识别固定在αFc-NP上，IgG同型对照或αFc偶联到AF750标记的NP上，然后与AF647标记的αPD1孵育。将混合物( (IgGNPαPD1或 αFc-NPαPD1)滴在载玻片上，沉淀10分钟，使用 SRiS STORM Super-resolution System (NanoBioImaging)获得图像。

为了证实αFc-NP可以同时整合两种单克隆抗体，将PerCP-Cy5.5偶联的αPDL1和FITC偶联的αPD1 (BioLegend)单独或与αFc-NP联合孵育12 h，然后进行高灵敏度纳米流式(HSFCM, NanoFCM)。该仪器配备了3个单光子计数雪崩光电二极管(APD)探测器，用于侧向散射(SSC)和双色荧光的同时检测。采集数据用FlowJo v10 (Tree Star)软件进行分析。

αFc-NPαPD1与5%葡萄糖孵育48 h，用Zetasizer Nano ZS检测其粒径变化，以检测其稳定性。为确定 IgG来源于相同或不同宿主对αFc-NPαPD1稳定性的影响，将αFc-NP结合PerCP-Cy5.5偶联PDL1( αFc-NPPP-Cy5.5-αPDL1)分别与 rat IgG control 和 mouse IgG control孵育， PerCP-Cy5.5-αPDL1, rat IgG control和mouse IgG浓度均为10μg/mL。用纳米流式检测仪(HSFCM, NanoFCM)检测孵育12 h和24 h后PerCP-Cy5.5+αFc-NPPP-Cy5.5-αPD1的比例。

三、 αPD1和αPDL1结合效率

αPD1或αPDL1与Fc-NP混合(质量比1:1)，在预定的时间(1、2、4、8、12、24 h)4℃孵育。在20000 g×60分钟离心，上清液中游离的αPD1和αPDL1通过ELISA检测。

四、抗原结合能力

用100μL (5μg/mL) rmPD1或rmPDL1包被ELISA板(康宁)，在37℃条件下2 h。然后在室温下用2% BSA（in PBST）中阻断1小时。加入一系列浓度的自由单抗(αPD1或αPDL1)或NP固定化单抗( αFc-NPαPD1/αFc-NPαPDL1)，在室温下孵育1小时。通过PRISM软件(GraphPad)绘制归一化的吸光度值与αPD1/αPDL1浓度之间的关系，得到解离常数kd。

五、 体外刺激肿瘤细胞和CD8+T细胞

用IFN-γ (20 ng/ml, Peprotech)刺激B16-F10或B16-F10mCherry细胞24小时。小心摘除小鼠脾脏，用无菌PBS在冰上清洗三次。脾细胞悬液经40μm尼龙网过滤。使用ACK(铵-氯-钾)溶解缓冲液(BioLegend)去除红细胞，然后脾细胞在 magnetic-activated cell sorting (MACS) buffer中重悬，CD8+T细胞通过 CD8a (Ly2) microbeadsIsolation Kit (Miltenyi Biotec.)分离。对于T细胞刺激，分离的CD8+T细胞与板结合抗CD3抗体(5 μg/mL, BioLegend)和可溶性抗CD28抗体(5 μg/mL, BioLegend)孵育48小时。使用BD FACSCelesta?流式细胞仪(BD Biosciences)评估刺激后PD1或PDL1的表达情况。

六、 细胞与imNAαPD1和αPDL1的联系

将1.0×10^5刺激后的B16-F10细胞或CD8+T细胞接种到24孔板培养过夜，然后加入αFc-NP固定IgG对照(αFcNPIgG)或αFc-NP固定αPD1和αPDL1 (imNAαPD1和αPDL1)。用FITC标记NPs，αPD1和αPDL1的浓度为10 μg/mL。每次时间间隔后，细胞用冰PBS洗涤三次，在BD FACSCelesta?流式细胞仪(BD Biosciences)上检测来自B16-F10细胞或CD8+T细胞的FITC平均荧光强度(MFI)。为了区分内化和表面结合的αFc-NPIgGor imNAαPD1和αPDL1，用台潘蓝(0.4%，Thermo Fisher Scientific)(已被证明在与FITC标记化合物密切接触时可以猝灭荧光)用于猝灭表面结合荧光，并在上流式之前添加到细胞悬液中。表面结合荧光(SBF)的计算公式如下:SBF=A?B，其中A和B分别表示不含或含台盼蓝猝灭的MFI。

为了直观观察细胞与imNAαPD1和αPDL1之间的联系，使用 PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma)，用红色荧光染料标记B16F10细胞或CD8+T细胞，然后与FITC标记的imNAαPD1和αPDL1孵育12小时，随后使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。

七、imNAαPD1& αPDL1促进肿瘤细胞和CD8+T细胞之间的相互作用

B16-F10-mCherry细胞和分离的CD8+T细胞以前文所述方法进行刺激。将B16-F10-mCherry细胞以每皿5.0×10^3个细胞的密度接种到Nunc?玻璃底培养皿(Thermo Fisher Scientific)中，4小时后加入5.0 ×10^4个CFSE标记的CD8+T细胞。共培养细胞分别用IgG (20 μg/mL)、FreeαPD1 & αPDL1、NPαPD1& NP αPDL1或imNAαPD1 & αPDL1处理。αPD1和αPDL1的浓度为10μg/mL。再孵育8 h后，移除悬浮的CD8+T细胞，在 Zeiss LSM880激光扫描共聚焦显微镜下观察T细胞-肿瘤细胞的结合物。结合率，以B16-F10细胞结合一个或多个CD8+T细胞的百分比来衡量，通过 ImageJ v1.47 (美国国立卫生研究院)在多个非重叠图像中观察红/绿接触来手工计数。

八、ELISA检测 IFN-γ, granzyme B和perforin

九、 体外凋亡实验

检测非抗原特异性T细胞的细胞毒性，B16-F10-mCherry细胞以5.0×10^3个/孔的密度接种到 CellCarrierUltra ULA 96-well microplates (PerkinElmer)12 h。然后加入5.0×10^4刺激后的标记了 CellTrace Blue 的CD8 + T细胞。共培养细胞分别用IgG (20 μg/mL)、FreeαPD1 & αPDL1、N PαPD1& N p αPDL1或imNAαPD1 & αPDL1处理。αPD1和αPDL1的浓度为10 μg/mL。将Annexin V-FITC（Thermo Fisher )加入终浓度为1μg/mL的培养基中检测凋亡细胞。将培养皿置于37°C和5% CO2下孵育，使用 Operetta CLS? High-Content Analysis System (PerkinElmer)，48小时每隔45分钟连续获取共培养细胞图像。使用 Harmony? high-content analysis software评估B16-F10细胞的活力参数。

检测抗原特异性T细胞的细胞毒性，CD8+T细胞从OT-1转基因小鼠分离培养并用anti-CD3/28抗体(5μg / mL) 刺激24 h。然后CD8+T细胞和 Hoechst 33342 标记的B16-F10-OVA细胞以5:1或10:1的比例在100?L培养基（含 IgG control antibody (20 μg/mL), FreeαPD1 & αPDL1, N PαPD1 & N PαPDL1or imNAαPD1 & αPDL1）中共培养48h。共孵育后，上清液中和贴壁细胞的H33342用 Infinite? 200 PRO microplate plate reader进行检测，细胞活力用以下公式计算：细胞生存能力= (A - B) /A，A为H33342的总量，B是上清液中的H33342。

十、 体内 imNAαPD1 & αPDL1 的肿瘤积累和细胞相互作用

为研究imNAαPD1&αPDL1的肿瘤积聚，在雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)乳腺脂肪垫中注射5.0 × 10^5个4T1细胞建立原位乳腺肿瘤模型。当肿瘤体积接近300 mm3时，将小鼠随机分为3组，分别静脉注射PBS、FreeαPD1 & αPDL1和imNAαPD1 & αPDL1。αPD1和αPDL1用Cy5染色(Thermo Fisher Scientific)标记，Cy5标记的αPD1和αPDL1注射剂量为5.0 mg / kg小鼠体重。在预定的时间间隔内处死小鼠，利用 In-Vivo Xtreme II imaging system (Bruker)对肿瘤组织进行荧光成像。利用 Molecular Imaging Software (Bruker)对采集的图像进行分析。4℃下4%多聚甲醛(Sigma)固定一夜，30%蔗糖溶液浸泡一夜，切片10 μm, DAPI染色后共聚焦显微镜观察(Zeiss)。

为了验证imNAαPD1&αPDL1是否能增强CD8+T细胞和肿瘤细胞之间的相互作用，4T1-GFP肿瘤小鼠用FreeαPD1&αPDL1或imNAαPD1&αPDL1(5mg /kg，每3天，共3次)治疗，最终注射后24 h，采集肿瘤组织，用抗CD8a抗体和Alexa Fluor?568标记山羊抗兔IgG H&L抗体染色，然后共聚焦观察。

十一、 抗肿瘤研究

在皮下黑色素瘤模型中，将2.0×10^5个B16-F10细胞以100 μL PBS接种于6-8周龄雌性C57BL/6小鼠的右侧皮下。雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫注射4T1细胞5.0 ×10^5个，建立原位乳腺肿瘤模型。当肿瘤体积约为50mm3时，将小鼠随机分为4组(每组6只或10只)，按每3天注射一次，共注射3次，静脉或瘤内给药。对于imNAαPD1&αPDL1，αPD1和αPDL1的剂量为2.5 mg/kg，而对于imNAKLRG1&αPDL1和imNAαCSF1R&αCD47，αKLRG1、αPDL1、αCSFR1和αCD47的剂量为1.5 mg/kg。用卡尺测量肿瘤垂直直径监测肿瘤体积，根据以下公式计算估算体积:V=L×W2×1/2 (V,体积;L,长度;W:肿瘤宽度)。每三天监测一次体重。采用Kaplan-Meier生存分析表达生存率。

在肺转移模型中，7.5×10^4个4T1-fLuc细胞或5.0×10^4个B16-F10细胞通过尾静脉注入BALB/c或C57BL/6雌性小鼠，并于第二天开始治疗。小鼠以200?L PBS腹腔注射D-荧光素(大连美伦)3mg，然后使用 InVivo Xtreme II imaging system (Bruker)观察。第16天，BALB/c小鼠在D-荧光素溶液中浸泡后分离肺进行生物发光成像。第20天，处死C57BL/6小鼠，分离肺。计数并记录肺组织转移灶。然后用4%多聚甲醛(Sigma)固定肺组织，石蜡包埋。切开石蜡包埋的肺，苏木精-伊红染色进行免疫组化分析。

十二、流式分析

取肿瘤组织切碎，加入含有10%胎牛血清(v/v)、I型胶原酶(1 mg/mL)、透明质酸酶(100 μg/mL)和DNase I (100 μg/mL)的RPMI-1640培养基，37°C持续搅拌25 min。消化后的细胞通过40 μm尼龙网，500 g离心10 min，然后裂解红细胞(RBC)。流式细胞术检测100ul细胞悬液(2.0 × 10^7个细胞/mL)。对于T细胞亚群的分析，细胞用以下抗体混合物染色: Alexa Fluor? 700-conjugated antibody to CD45 (Clone: 30-F11, dilution: 1:200), FITC-conjugated antibody to CD3 (Clone: 17A2, dilution: 1:400), BV650-conjugated antibody to CD8 (Clone: 53-6.7, dilution: 1:200), PE/Dazzle 594-conjugated antibody to CD4 (Clone: GK1.5, dilution: 1:200), and PE-conjugated antibody to CD25 (Clone: 3C7, dilution: 1:100). BV, brilliant violet; FITC, fluorescein isothiocyanate; PE, phycoerythrin。

胞内因子染色，2.0×10^6个肿瘤浸润淋巴细胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中接种到6孔板中，并添加 eBioscience? Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors)。刺激后，对细胞进行表面标记。用 Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (BioLegend)固定和破膜。然后用 PerCP-Cy5.5-conjugated antibody to IL2 (Clone: JES6-5H4, dilution: 1:200), PE-conjugated antibody to IFN-γ (Clone: XMG1.2, dilution: 1:200) and Alexa Fluor? 647-conjugated antibody to Granzyme B (Clone: GB11, dilution: 1:200)进行染色。所有样本在BD LSRFortessa?流式细胞仪上采集，数据使用FlowJo v10 (Tree Star)进行分析。

十三、数据重复性

所有实验至少重复两次，结果一致。

结果展示：

结果就展示这么多，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，或者私聊我要文献资料，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Jiang, CT; Chen, KG; Liu, A; et al.Immunomodulating nano-adaptors potentiate antibody-based cancer immunotherapy.[J].Nat Commun.2021,12(1):1359

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2021-05-31 19:51   回复  
NanoFCMlxq(金币+2): 谢谢参与
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17850535243楼
2021-05-31 19:52   回复  
NanoFCMlxq(金币+1): 谢谢参与
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a23669746844楼
2021-05-31 19:56   回复  
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01099505845楼
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