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今天分享一篇发表在Angewandte Chemie（2020年IF=13.734）上的文章，名为《Quantitative Assessment of the Physical Virus Titer and Purity by Ultrasensitive Flow Virometry》[1]（用超灵敏流式病毒测定法定量测定病毒的物理效价和纯度）。
自2019年12月以来，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARSCoV-2)引起的冠状病毒病-19 (COVID-19)已影响全球9600多万人。虽然病毒感染仍然是世界范围内发病率和死亡率的主要原因，但基于病毒的产品正在被开发用于各种生物医学应用。例如，基于灭活或减毒病毒的疫苗是预防传染病的第一道防线。重组腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等病毒被广泛用作基因治疗载体。溶瘤病毒具有特异性感染和杀死癌细胞的能力，被用作癌症治疗药物。此外，噬菌体被用于对抗耐抗生素细菌，并在食品工业和畜牧业中作为生物防治剂。此外，病毒纳米颗粒的外表面和内表面都可以通过化学或基因修饰来设计，以显示免疫原性，靶向特定细胞，并提供治疗载荷。
病毒效价的测定一直是病毒学的基本要求，也是一项艰巨而富有挑战性的工作。鉴于病毒制剂中存在大量杂质，如细胞碎片、不完全或异常形式的病毒颗粒、牛血清白蛋白的聚集物和游离核酸等，与完全成熟的病毒粒子共存，确定病毒的真实效价是确保病毒效力的最重要的质量控制措施之一。空斑试验是病毒定量的经典方法，但需要1-2周(哺乳动物病毒)或1-2天(噬菌体)来确定感染滴度。虽然酶联免疫吸附试验(ELISA)和定量聚合酶链反应(qPCR)可以分别测定病毒的特定蛋白和核酸序列，但这些“批量”分析方法的严格性较低，因为它们无法区分来自完全病毒粒子或空衣壳、可溶性病毒蛋白和包裹在衣壳内或溶液中游离的病毒核酸的蛋白质。尽管不断有新的、精细的病毒检测方法被开发出来，但只有很少的方法适用于病毒产品的常规研究或质量控制。
随着仪器设备、荧光染料和标记策略的发展，流式细胞术(flow cytometry)已被用于单个细胞分析，并被用于单个病毒颗粒分析，最近被称为“流式病毒分析术”。然而，由于病毒尺寸小(17-350nm，大多数接近或小于100nm)，散射强度与颗粒尺寸呈指数相关性，单个病毒的弹性散射光通常低于仪器的检测限度，导致病毒浓度计数不足。尽管在商业仪器和定制仪器上对单个病毒的检测已经做出了很大的努力，但用光散射测量来检测小于100 nm的病毒仍然很困难。因此，通常采用核酸染色来区分病毒和非荧光背景噪声。尽管如此，在病毒制备中，同时检测单颗粒散射光对于区分完整病毒粒子和其他非传染性污染物很重要。将鞘流单分子荧光检测技术与降低检测区背景的方法相结合，我们构建了一个纳米流式仪(nFCM)，能够使用光散射检测单个二氧化硅纳米颗粒和直径分别小至24和27nm的病毒。对于nFCM，纳米颗粒尺寸的分辨率与电子显微镜相当，其尺寸范围涵盖了绝大多数病毒。与传统FCM相比，nFCM的灵敏度显著提高，其原因是基于以下综合效应：1)减少了探针体积(约25 fL)以降低背景；2)延长了纳米粒子在激光束中的停留时间(0.3-2 ms)以增加光子产生；3)单光子计数雪崩光电二极管(APD)探测器，以提高光子检测的量子效率；4)优良的光学，限制视场的APD探测器仅对样本流，非常好的减少背景。利用nFCM在单纳米颗粒侧向散射和荧光检测方面的优越性，我们开发了一种简单快速的方法来定量病毒的物理效度和纯度。首次采用SYTO 82核酸染色，在不固定、不加热的情况下，有效标记DNA、RNA、包膜和非包膜病毒等各类病毒的核酸。
使用噬菌体T7(二十面体衣壳55nm直径的头部，包含DNA长度为39937bp的基因组)作为模型，图1显示了使用实验室建立的nFCM原理图，同时检测单一病毒的散射(SSC)和荧光(FL)。利用SYTO 82膜透性染料标记病毒10 min，其信号良好，样品外显率优良。DNA结合的SYTO 82的荧光激发和发射最大值分别为541 nm和560 nm。完整的病毒粒子、空衣壳和游离的病毒核酸有望表现出SSC和FL信号的不同特征。图1 b显示了纯化的噬菌体T7用1uM SYTO 82染色。由于nFCM具有优越的灵敏度，对于每个T7病毒粒子，散射光和荧光信号同时检测，信噪比(S/N)为253/74。数据采集1分钟后，FL和SSC的二维散点图和各自的直方图如图1 c。100nm已知浓度的荧光聚苯乙烯微球作为外部标准来确定病毒粒子的浓度。
噬菌体T7的检测浓度在1.8 X 10^5到1.3X 10^8 PFU mL^-1, nFCM分析与空斑计数线性相关，R^2为0.999，斜率为1.094±0.004。如表1所示，噬菌体T7的可靠计数可在浓度低至2 X 10^5 VP mL^-1，数据采集时间为1分钟进行获取。如果数据采集时间延长到10min或更久，应采用浓度为2 X 10^4 VP mL^-1或更低。这种检测限(LOD)肯定低于空斑试验或基于qPCR的技术的1-10病毒。然而，用nFCM计数可以在不到30分钟内完成，并可以消除溶液中病毒核酸的干扰。因此nFCM对于病毒浓度通常高于10^6 VP mL^-1的病毒产品的常规质量控制更加有效和实用。
对完整病毒和病毒样颗粒的有效区分是有效定量病毒滴度的前提。为了检验用nFCM区分完整病毒粒子、空衣壳和病毒基因组的可行性，首先用1uM SYTO 82染色后分别分析这三种成分。类似于图1 b，图2 a表示完整T7病毒粒子的SSC信号和FL信号具有极好的灵敏度。对于T7空衣壳，只检测到SSC信号，丰度远低于完整T7病毒粒子，这可以归因于空衣壳的折射率比完整的病毒粒子的折射率低，因此散射较少的激光。图2c显示，溶液中游离的T7 DNA只显示出FL信号，没有同时检测到散射光。然而，令我们惊讶的是，FL的峰值高度仅为完整T7病毒粒子的48%，这与核酸长度相等的情况不一致。然后我们将这三种成分混合，并用nFCM进行分析。图2d显示了SSC和FL信号的典型信号峰，其中T7的典型完整病毒粒子、空衣壳和病毒DNA分别用红圈、蓝星和绿色方框标记。FL和SSC的二维散点图表明T7衣壳和T7 DNA可以和T7完整病毒清晰区分(图2e)。有趣的是，病毒包含的DNA分子荧光强度和T7游离DNA大约是相同的，尽管有很大程度上不同的荧光峰值高度。这一现象可以通过比较这两种成分的峰高和峰宽来解释。由于在样品进入流动池的地方产生的水动力的拉伸，以扩展的构型通过检测探头，导致较低的峰值信号但较长的脉冲持续时间。单个病毒粒子与空病毒衣壳和游离病毒DNA的明显区别表明，nFCM在表征基于病毒的基因传递系统的诱捕效率方面具有巨大的潜力。
病毒进化出了专门的分子机制，在其感染的细胞内有效地运输它们的基因组，从而可以作为纳米尺度的载体，将核酸运送到宿主细胞。例如，腺病毒(Ad)载体已在基因传递的实验和临床模型中得到广泛研究。腺病毒是一种非包膜病毒，具有80-120 nm的二十面体蛋白衣壳，包含约36000 bp的dsDNA基因组。在重组Ad (rAd)的生产过程中，空衣壳和未完全加工的病毒蛋白总是与成熟的病毒粒子共存(图3a)。因此，基因转移的有效性将显著影响在给定的病毒载体中感染颗粒的百分比。图3b和3c显示了一个商用rAd-EGFP载体的nFCM分析，该载体是通过将一个绿色荧光蛋白基因传递到神经元上而开发的，用于神经追踪。为了使游离DNA引起的荧光背景最小化，将商品化的rAd-EGFP载体稀释810倍，用DNase I (1.4 UuL^-1, 37℃ 30分钟)，然后用1uM SYTO 82溶液和2uM SYTO 82溶液1:1混合进行染色。我们可以从FL和SSC的二维散点图中看到，成熟的rAd-GFP病毒粒子(橙色点)在核酸染色时很容易与杂质(绿色点)区分，和rAd-EGFP样品的纯度(定义为成熟的病毒粒子除以总事件)(图3b) 为43.5%。值得注意的是，总粒子数可能大部分来自宿主细胞分泌的细胞外囊泡，因为它们是常见的病毒制剂污染物。
结果就展示这么多，文章还对商品化噬菌体cocktail、病毒疫苗的检测做了分析，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，或者私聊我要文献资料，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~
参考文献：
[1]Niu, Q; Ma, L; Zhu, S; et al.Quantitative Assessment of the Physical Virus Titer and Purity by Ultrasensitive Flow Virometry.[J].Angew Chem Int Ed Engl.2021,60(17):9351-9356
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