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潘小阳阳阳

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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帖子: 9
在线: 42分钟
虫号: 26381215
注册: 2021-05-11
专业: 生物化学

[求助] 为什么从T载切下来的目的片段连接不上目的载体？已有1人参与

首先我的目的片段2.3kb左右、T载2kb左右、目的载体12kb左右，好不容易连接上了T载，然后测序正确。就开始从T载上面酶切目的片段（条带一小点不容易分开），应该影响不大，毕竟T载和目的载体抗性不同，之后酶切目的载体。用T4连接酶连接目的载体和目的片段，单克隆长得挺好，阳检目的片段无条带，死活连不上去。目的载体应该没有问题，因为连接另外一个0.4kb左右的目的片段已经成功（酶切位点和2.3kb的酶切位点一样）请教各位大神接下来要怎么办？自己做过的改进：
1.目的片段应该正确，因为从T载上酶切时条带正确，已经改变好几次目的片段浓度，增加过0.5倍、1倍甚至两倍
2.16度过夜酶切过12h、16h、18h，
3.之前担心还是目的片段问题、又重新做了几遍，结果一样
4.酶切位点的选择确定完全正确
这些改变的结果都是有菌落产生、阳检目的片段长度没有条带只有引物二聚体
孩子实在是没办法了，求教各位大神！
小女子在此拜谢

发自小木虫IOS客户端

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