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今天分享一篇发表在 J Extracell Vesicles（2020年IF=14.98）上的文章，名为《Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge?》[1]（用正交法测定多模式合成标准物质和细胞外囊泡的颗粒浓度:谁能胜任这一挑战?）
本研究在可重复性、准确性和可接受性方面，通过深入分析EVs分离物的关键质量属性：浓度和尺寸分布，为50-300nm范围的颗粒浓度测量进一步开发可靠的技术和分析方案。全面详细的对比了NTA、TRPS、nFCM、CLS、AF4-MALS和MADLS这6种方法，具体如下表。
研究过程：
一、 聚苯乙烯颗粒
从Thermo Scientific购得60nm (+/i- 4nm)、100nm (+/- 3nm)、152 (+/- 5nm)、203 (+/- 5nm)、240 (+/- 5nm)物理直径的NIST可溯源聚苯乙烯颗粒。这些平均直径是由Thermo Scientific使用透射电子显微镜(TEM)认证的。颗粒浓度以%(M/V)固体方式(所有上述标准为1%固体溶于水)，分别的名义浓度以“颗粒/ml”通过聚苯乙烯的平均直径和密度为1.05 g/cm3，计算得到分别为8.4E+13/ml, 1.82E+13/ml, 5.18E+12/ml, 2.17E+12/ml和1.32E+12/ml, 分别为CPN60, CPN100, CPN150，CPN200和CPN240。
由于缺乏CPN粒子浓度的可溯源信息，NIST可溯源标准的相对标称浓度(范围为60-2500nm)采用TRPS进行预分析。如补充信息(SI)中所述，本研究中使用的NIST可溯源标准的完整尺寸和浓度表征受到最大关注。然后使用NTA、TRPS、MADLS、CLS、nFCM和AF4-MALS对含有CPN60、CPN100、CPN150、CPN200和CPN240聚苯乙烯珠的混合物样品的粒径和浓度进行评估。
二、 聚苯乙烯颗粒混合物制备
用D-PBS (CaCl2和MgCl2) + 0.03% 吐温-20对CPN60、CPN100、CPN150、CPN200、CPN240分别进行稀释。根据平均尺寸、固体含量和密度信息计算的初始颗粒浓度，按照表2中详细列出的体积稀释法，将每个标准品的浓度降低到10^10/ml，用于生产后续混合物。
使用一套稀释至10^10/ml浓度的标准品，由一个独立方配制了10种不同成分的混合物。这些混合物，以及单峰标准本身，使用不同的技术进行分析，每个操作者进行盲测以防止偏差。
三、脂质体
本研究中使用的聚乙二醇脂质体配方相当于Doxil(脂质体阿霉素，R)的非药物对照。脂质体配方由三种不同的脂质组成：胆固醇、HSPC和MPEG-DSPE，重量比为20.7 : 57.9 : 21.9，总脂质含量为15.6 mg/ml。脂质体购自lipoure。根据分析，本研究中使用的批次(批次#500010)的平均水动力直径为78 nm。
四、 细胞外囊泡(EV)样品制备
使用凝血常规冻干血浆(diagnostics Stago)进行EV分离，也被定义为“小颗粒分离”。血浆样品按照说明书制作。重组后，将10?l凝血酶加入1 ml重组血浆中。将含凝血酶的血浆轻轻混合15 min, 3000×g离心15 min，将上清转移到新的微量管中。重复离心样品上清。随后使用MILLEXGP 0.22?m滤膜对样品进行过滤。
使用IZON qEV original/70nm size色谱柱，根据说明书进行EV分离。IZON提供的这些柱子包含孔隙大小约70nm的树脂，最适分离粒径范围为70 - 1000nm, 室温下大约1.0ml/min的流速，最大加载量0.5ml，柱子体积10ml，孔隙体积大约3ml。柱子由PBS预填充，包含0.05%的叠氮化钠。qEV柱分离EV的时间通常小于15分钟，得到高度纯化的囊泡。在尺寸排阻过程中，蛋白质和其他小于70 nm的污染分子进入树脂的孔，并延迟通过柱，主要是在包含EV的体积之外的洗脱。大部份的EVs在3ml的空隙体积之后的1.5ml中洗脱。随后采集500?l样本，并提供等分样本用于几种不同方法检测。
五、 纳米粒子跟踪分析（NTA）
用D-PBS (CaCl2和MgCl2) + 0.03% tween-20配制NTA的样品稀释液，工作体积为1ml，以获得NTA的最佳颗粒浓度(每个视场10到50个颗粒)。样品在加载前进行短暂的涡旋，以确保充分的混合和均匀性。将样品(约600?l)装入NanoSight仪器。所有样品(聚苯乙烯、脂质体和EV分离物)均进行3个重复测定。
在将nFCM添加到用于本研究比较的技术中，使用NTA和TRPS对聚苯乙烯单模态和多模态样品进行了再次评估，并将结果与原始测量结果进行了比较。NTA仪器设置保持不变，以使测量结果具有可比性。这样做是为了确认聚苯乙烯基样品从原始测量到nFCM测量完成期间的稳定性和完整性。
六、可调谐电阻脉冲传感（TPRS）
TRPS属于电阻脉冲传感分析技术，其中胶体粒子悬浮在导电溶液中，通过膜上的一个或多个孔，产生电阻脉冲。这些电脉冲可以通过IZON Science Control Suite v. 3.3进行收集和分析，作为qNano的接口，并执行所需的校准，将测量到的孔隙堵塞的数量和大小分别转换为颗粒浓度和直径。
将含有表面活性剂(0.03%吐温-20)的PBS液分别放置在含有一个电极的液体槽内，分别放置在qNano上的纳米孔下面(75?L)和上面(35?L)。其模拟数字转换器在1 MHz下工作，通过电子滤波降低到50 kHz的采样频率。该系统配备了一个基于空气的压力模块，以应用所需的压力范围。在TPU膜中配置了可调纳米孔。所有样品进行3次重复。
七、纳米流式（NanoFCM）
纳米流式技术采用专业设备将标准流式细胞术的基本原理应用于亚微米颗粒。NanoAnalyzer (nanoFCM)进行了优化，以便利用散射光(SSC)测量生物粒子如EVs和病毒等，能够检测到低至40nmd的颗粒。另外还有两个荧光通道可以进一步表征粒子。
NanoAnalyzer N30仪器配备了单个488nm激光器和单光子计数雪崩光电二极管探测器(SPCM APDs)，用于检测单个粒子的SSC(带通滤光片：FF01?524/24)。HPLC级水通过重力进给作为鞘液，使样品液直径减小到约1.4?m。数据是通过NanoFCM Professional Suite v1.8软件生成的，通过使用空白来扣除背景。
测量时间1分钟，采样压力为1.0 kPa，由气压模块调节并保持。样品按要求用PBS稀释，在1分钟内记录2000-12000个粒子。
在数据采集过程中，样品流在聚焦激光束的中心区域内被完全照亮，产生了大约100%的检测效率，从而通过单粒子计数实现精确的粒子浓度测量。
样品的浓度通过与已知颗粒浓度的250 nm二氧化硅颗粒的比较来确定。粒径校准则是使用专用的四种二氧化硅纳米球cocktail，包含直径为68nm、91nm、113nm和155nm的纳米球。用幂函数f = c*d^n拟合四种不同二氧化硅颗粒的侧向散射强度与颗粒直径的关系，得到标准曲线。对于EV和脂质体的测量，硅混合物的最佳匹配度n约为5.3。生成的标准曲线用于脂质体和EV大小测量。需注意，瑞利散射通常适用于粒子直径d小于入射光的波长的1/10——在我们的例子中激光波长488nm，瑞利理论适用于d<50 nm，此时散射强度尺度为d^6。
二氧化硅提供了稳定的单分散标准，折射率约为1.43-1.46，接近文献报道的EV 的折射率范围(n=1.37-1.42)。使用这种校准标准可以实现精确的尺寸测量，这在nFCM与低温透射电镜结果比较时得到证实。脂质体的折射率也被假定为类似于二氧化硅，由于其脂质和生物组成的变化，在数据解释过程中仍然是重要的考虑因素。
由于聚苯乙烯的折射率与二氧化硅非常不同，聚苯乙烯样品的尺寸是通过与CPN和NIST粒子的多模态cocktail进行比较。将混合样品中粒子的侧向散射强度与CPN60, CPN100, CPN150的三峰混合物进行了比较。
八、离心液体沉降（CLS）
离心液体沉降，使用CPS盘式离心机(型号DC24000 UHR)在液体密度梯度介质中通过离心沉降分离不同大小颗粒。及时测量时，沉降过程会导致探测器前粒子浓度的变化。沉降时间与沉降速度相对应，对于分离的颗粒，沉降速度取决于它们各自的大小、形状和密度。该仪器应用斯托克斯定律来计算在给定密度下对应于一定沉降时间的大小。利用Mie理论，利用材料在光源波长(405nm)处的折射率和吸收值，计算了测量光消光后的粒子质量浓度。根据圆盘的几何特征和探测器的位置，利用仪器软件生成质量加权尺寸分布曲线。
分离的密度梯度为9步，转速为22000rpm，浓度梯度为1.6 ml的0%-8%蔗糖溶液。聚苯乙烯和EV的折射率分别为1.62和1.42，密度分别为1.05和1.07g/ml。聚苯乙烯和EV分离物的吸附值均设为0.001。为了防止蔗糖梯度水分蒸发，在最后一层上加了0.5 ml梯度盖液（ dodecane）。CPS尺寸校准标准，即在每次测量前注射一种单分散球形聚氯乙烯(PVC)颗粒的水悬液，直径为237nm，以确定梯度的实际性质(密度、粘度)。
九、使用多角度光散射检测器在线进行非对称流场流分离(AF4-MALS)
本研究中使用的AF4系统包括Eclipse Dualtec分离系统(Wyatt Technology Corp)和安捷伦1260 Infinity高性能液相色谱仪，配有除气器(G1322A)、等度泵(G1310B)、自动进样器(G1329B)和多波长检测器(G1365C)，全部来自安捷伦(Agilent Technologies)。一个DAWN 8+ HELEOS II多角度激光光散射(MALS)探测器与658nm激光( Wyatt Technology)耦合到分离系统。90?探测器角度用于监测信号分析。再生纤维素(10kDa)膜用于Eclipse SC分离通道(153 mm长)。间隔层高度为350?m。通道的温度保持在25?C。
十、 多角度动态光散射（MADLS）
MADLS使用Zetasizer Ultra (Malvern Panalytical)进行。样品体积约为1ml，装入DTS0012比色皿。每个样品的尺寸分布，模式粒径和颗粒浓度使用探测器在三个不同的角度测量，以考虑前(13?)，边(90?)和后(NIBS 173?)散射光。每个样本在每个角度测量三次，并应用 adaptive correlation，以提高总体数据质量。数据处理使用ZS Xplorer Software Suite V 1.1.0.656。
结果就展示这么多，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，或者私聊我要文献资料，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~
参考文献：
[1]Vogel, R; Savage, J; Muzard, J; et al.Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge?[J].J Extracell Vesicles.2021,10(3):e12052
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