外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（六） - 生物科学 - 细胞科学

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今天分享一篇发表在Journal of Nanobiotechnology（2020年IF=6.518）上的文章，名为《Micro/nano-textured hierarchical titanium topography promotes exosome biogenesis and secretion to improve osseointegration》[1]（微/纳米结构的分级钛形貌促进外泌体的生物发生和分泌，以改善骨整合）。

骨质疏松患者种植牙的失败率超过10%，原因是牙槽骨密度下降，牙缺失后再生能力较差，抑制骨质疏松患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖和成骨分化能力。骨髓间充质干细胞和由骨髓间充质干细胞衍生的分泌产物在骨与钛种植体之间的骨整合发挥着重要作用。钛种植体的表面设计已被重视以优化良好的钛形貌对骨髓间充质干细胞的生物反应。然而，关于钛形貌在骨髓间充质干细胞分泌产物调控中的作用知之甚少。

外泌体是由各种类型的细胞合成和分泌的，如细胞外囊泡(EVs)，它将核酸、蛋白质、脂质和其他活性分子传递到邻近的细胞中，进行细胞间的通信。钛种植体、骨髓间充质干细胞和外泌体之间的相互作用在骨整合过程中至关重要。体内和体外实验表明，骨髓间充质干细胞分泌的外泌体通过激活PI3k/Akt通路，增强骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化，并促进骨再生。小GTPase Rab27和鞘磷脂磷酸二酯酶3(SMPD3)通路控制外泌体的合成和分泌。分别通过shRNA和GW4869检测，Rab27敲除和smpd3抑制细胞的外泌体释放明显减少。近年来，外泌体集成的钛盘通过增强骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化，具有良好的靶向成骨生物功能。已有报道称，钛表面的理化特性会影响干细胞的生物学行为和功能。然而，钛形貌如何影响骨髓间充质干细胞分泌外泌体尚不清楚。

最近，随着最新增材制造技术-选择性激光熔化技术(SLM)的快速发展，复杂无牙槽嵴的定制钛种植体已经成为可能，允许精确控制种植体设计。此外，由于SLM种植体的表面粗糙度过大，骨和SLM种植体之间的界面行为优于转向种植体，但低于商业种植体。通过构建与骨组织微观结构相似的仿生形貌，对转向的或原生SLM钛合金形貌进行表面修饰以改善BMSCs在种植体上的性能已得到广泛研究。分级多孔结构作为基因传递的纳米载体和组织再生的框架已被广泛研究。据报道，在体外和体内，微/纳米纹理的分级钛结构比光滑的、原生SLM或微纹理的钛结构更具有生物活性和仿生性，可以增强骨髓间质干细胞的成骨分化和骨-种植体骨融合。微/纳米纹理的分级钛的表面修饰通常通过阳极氧化、碱热处理或喷砂或酸蚀刻在微纹理钛基上的电化学沉积进行。体外研究表明，结合酸蚀刻和阳极氧化技术或结合酸蚀刻和碱热处理技术的微/纳米纹理形貌显著增强了BMSCs在钛表面的行为。这些研究只关注在设计的形貌下BMSCs的增殖和成骨分化结果。微/纳米结构的表面形貌与细胞相互作用增强骨髓间充质干细胞的生物活性和骨整合的确切机制尚不清楚。考虑到骨髓间充质干细胞来源的外泌体在骨整合中的重要性，微/纳米结构的形貌可能会影响骨髓间充质干细胞的外泌体分泌，进而调节细胞-钛活性和钛表面的细胞间通信。

本研究我们确定了来自骨髓间充质干细胞的外泌体的分泌行为是否受到不同钛形态的影响。此外，我们试图探索钛形貌在体内和体外对骨髓间充质干细胞外泌体分泌的影响和机制。

研究过程：

一、形貌表征

采用场发射扫描电镜(FE-SEM)测定各组的表面形貌。SLM样本显示粗糙和波动曲面并且有一些未消融的钛球体(直径28.29±0.64μm)。SLA样本显示均匀分布的微米大小的坑(直径平均5.62±0.65μm)，在喷砂和酸浸后没有SLM样品的残余粒子。SLM和SLA样品表面均未发现纳米纹理的钛形貌。在低倍率下，SAH和SAO样品显示了相同的直径超过1μm的浅坑表面，类似于SLA表面上微米大小的坑。在高倍率下，SAH样品外有301.52±51.22 nm的大孔，内有76.27±15.57 nm的小孔(图1h)。在SAO样品上形成了均匀排列的纳米管(平均直径55.36±6.16 nm)。

二、鉴定 hBMSCs

流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。hBMSCs间充质干细胞标志物(CD73、CD90、CD105和CD29)的阳性率超过99%，造血表面抗原(CD45、CD19、CD34、HLA-DR和CD11b)为阴性。与非诱导组相比，hBMSCs的成骨、成脂和软骨分化潜能被测定。成骨分化培养11天后，茜素红染色显示细胞外钙沉积。成脂分化培养11天后，油红O染色显示细胞内脂质包涵体形成。在软骨分化培养条件下培养21天后，经藏红O染色，细胞团块切片显示蛋白多糖沉积和软骨陷窝形成。

三、细胞活性检测

扫描电镜观察细胞粘附和形态。SLM和SLA样品上的细胞是多角形的，带有短片状足。SAH和SAO样品中均发现带有指状丝状足凸的细长胞体，微小的突起从这些细胞延伸到微/纳米结构的分层钛结构。用CCK-8检测细胞增殖情况，第一天，SAO组与SLA组之间、SAH组与SLM组之间均没有显著差异(p > 0.05)。SAO组在第3、5、7天对hBMSCs增殖的促进作用最强(p < 0.05)，其次是SLA组和SAH组。

四、hBMSCs来源外泌体的表征

hBMSCs来源的外泌体显示单层膜囊泡，具有圆形葡萄状结构。通过纳米流式仪检测，样品粒径分布为30 ~ 150 nm(中位数±SD, 73.0±18.7 nm)。纳米流式仪检测样本CD63(56.8%)和CD81(50.8%)均为阳性表达。此外，western blotting分析显示，hBMSCs来源的外泌体显示外泌体标记(CD63和TSG101)阳性表达，Calnexin阴性。

五、乙酰胆碱酯酶活性检测评估钛形貌对外泌体分泌的影响

通过分离的外泌体的AChE活性定量测定上清中释放的外泌体。乙酰胆碱酯酶活性在SAH和SAO组中显著高于SLM和SLA组(p < 0.05)。此外，SLA组分泌的外泌体明显多于SLM组(p < 0.05)。

六、胞内CD63在不同钛表面的分布

免疫荧光染色结果显示四组细胞核相似，细胞活力评价细胞粘附和形态结果相似。SLA样品上的细胞比SLM样品有更多的扩散区域和细胞内CD63的分布。SAH组和SAO组的细胞与相邻细胞相连的细长胞体组的细胞内CD63分布比SLM组和SLA组的细胞多。

七、钛形貌对外泌体分泌相关基因和蛋白表达水平的影响

先前的研究表明Rab27家族和SMPD3信号通过一系列步骤控制外泌体的分泌。培养48h后，采用qRT-PCR检测相对mRNA表达量。与其他3组相比，微/纳米结构的分级钛形貌显著提高了RAB27A、RAB27B和SMPD3的mRNA水平(p < 0.05)，但SAO组和SLA组之间的mRNA水平无显著差异(p > 0.05)。培养48 h后，通过WB测定相对蛋白表达水平。与其他三组相比，微/纳米结构的层次钛形貌显著增加了RAB27B和SMPD3的蛋白丰度(p < 0.05)。但SYTL4的表达(Rab27效应)在SAH、SAO和SLA组之间无显著差异(p > 0.05)。SLM组SMPD3蛋白表达显著高于微纳米结构的分级钛形貌组(p < 0.05)。

八、钛形貌对体内外泌体分泌和骨整合的影响

种植体放置后第7天，种植体部位的H&E染色显示清晰的线，成骨细胞冠尖对齐。四组均未见骨-种植体界面炎症细胞浸润。采用CD63免疫组化方法检测骨-植入界面的外泌体水平。CD63在SAH和SAO组的表达水平显著高于SLM和SLA组(p < 0.05)。观察和定量骨膜蛋白 Periostin(间充质干细胞的标记物)阳性细胞。骨膜蛋白在SAH和SAO组的表达水平显著高于SLM和SLA组(p < 0.05)，这与外泌体的表达水平一致。四组间CD11b(组织巨噬细胞标记物)的表达水平无显著差异(p > 0.05)，但CD11b阳性细胞聚集在骨-种植体界面附近。种植体放置后28天，组织学分析显示，SAH和SAO组的BIC比值显著高于SLM和SLA组(p < 0.05)。

结果就展示这么多，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，或者私聊我要文献资料，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Zhang, Z; Xu, R; Yang, Y; et al.Micro/nano-textured hierarchical titanium topography promotes exosome biogenesis and secretion to improve osseointegration.[J].J Nanobiotechnology.2021,19(1):78