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外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（四）
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今天分享一篇发表在Molecular Therapy（2020年IF=8.986）上的文章，名为《A versatile platform for generating engineered extracellular vesicles with defined therapeutic properties》[1]（ 一个用于产生具有明确治疗特性的工程细胞外囊泡的多功能平台）。该文是美国Codiak BioSciences公司发表的研究成果。

细胞外囊泡(EVs)是一种重要的细胞间通讯系统，促进了细胞间大分子的转移。将外源性分子结合到EV表面或包裹在其中是产生治疗性EV的关键策略。本研究鉴定了两种“支架”蛋白，PTGFRN和BASP1，它们被优先选择放到EV中，能够高密度的表达而且可以广泛装载各种分子，包括细胞因子、抗体片段、RNA结合蛋白、疫苗抗原、Cas9和TNF超家族成员。分子以高密度加载到EVs中，当融合到全长或截断形式的PTGFRN或BASP1时，显示出强大的体外活性。此外，这些工程EVs在各种动物模型中都保留了药效学活性。这个工程平台提供了一种简单的方法，用多样化的大分子来功能化EVs，并代表了一种释放EVs的治疗潜力的重要进步。

研究过程及结果：

一、 高密度EV支架蛋白的鉴定

我们认为，通过对高度纯化的EVs进行详细的表征，可确定能作为EVs装载功能性分子的支架蛋白。为此，我们开发了一种从大量细胞培养上清中严格且可重复纯化EVs的方法。从适应悬液的HEK293细胞中提取的细胞培养基通过连续的过滤和离心步骤处理，通过iodixanol梯度纯化得到粗EV颗粒。我们将这个梯度分成四个组分（F1-F4），收集迁移到相邻密度层之间的组分，并使用超微结构和生化技术分析这些组分是否存在EVs。

负染透射电镜(TEM)分析显示，在较低密度组分中主要存在直径为30- 200 nm的囊泡，而较高密度组分似乎主要包含蛋白质，非囊泡物质。冷冻透射电镜(cryo-EM)对F1的分析显示，负染透射电镜有不明显的无泡状、网状物质的存在。密度梯度分离后进行2万x g离心步骤去除这些主要由肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白组成的高阶复合物。去除这些成分后，cryo-EM证实存在脂膜分隔的囊泡，无细胞碎片。

我们发现，外泌体的主要脂质成分胆固醇主要存在于F1中，而大部分DNA和蛋白质存在于高密度组分中。纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定的F1、F3和F4的颗粒浓度相似，尽管TEM观察到的囊泡比例存在显著差异。蛋白酶K处理这些组分导致高密度组分NTA结果显著变化，而F1的影响最小。这些数据表明，需要详细的生化特性来区分EVs颗粒和非EVs颗粒，这些颗粒用不太严格的分离方法共同纯化。

SDS-PAGE和免疫印迹分析显示，经常报道的EV标记CD9、CD63、CD81和SDCBP富集在低密度组分F1和F2中，这与TEM观察到的囊泡含量一致。单颗粒流式细胞仪（NanoFCM）分析tetraspanin标记物表明F1中存在囊泡亚群，这与以前的报道一致。形成大的寡聚复合物的蛋白质，如 LGALS3BP和染色质相关的HMGB1和HIST3H3富集于F4中，而在低密度EVs富集组分中不存在。内质网蛋白CANX仅在细胞裂解液(CL)中发现，这表明在超离前大部分EV污染标记物已被去除。

通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)发现，已知的EV蛋白如PDCD6IP、MFGE8和整合素b1和a4在F1中富集，而在较高密度的组分F3和F4中基本不存在。F4主要由分泌的细胞外基质(ECM)蛋白(LAMA5/B1/C1、NID1、TNC、AGRN和HSPG2)和组蛋白(HIST-2H2AB、3H2BB、1H3A和2H2AC)组成，EVs相关蛋白基本被除去。免疫球蛋白超家族(IgSF)-EWI和MARCKS蛋白家族的几个成员在F1中高度富集，而在F3和F4中基本不存在，如TGFRN, IGSF8, MARCKS, MARCKSL1和BASP1。这些蛋白被选择作为EVs特异性支架候选者进行进一步评价。

结合电镜和生化分析，这些数据表明F1高度富集囊泡表达典型EV标记物，并且没有迁移到F2-F4的非囊泡物质。后续所有实验均使用F1 EVs进行。

二、 工程蛋白EVs富集

我们使用flag标记的GFP作为替代载体分子，评估了这些蛋白引导融合蛋白进入EVs的相对能力。将LC-MS/MS鉴定的5种EV蛋白与常用的EV定位蛋白：CD9，CD63，CD81，一种棕榈酰化标记Palm，pD和LAMP2B进行比较。通过使用编码GFP融合到每个支架上的质粒进行抗生素筛选，建立了稳定的悬浮适应的HEK293细胞系。除非另有说明，本报告中描述的所有工程EVs均来自稳定选择的细胞池。

GFP融合蛋白被包装进EVs的效率是通过比较细胞内和EVs中GFP水平来确定的。虽然通过流式检测，大多数靶向构建物的细胞GFP表达相似，但通过ELISA定量检测，EVs相关的GFP表达有广泛差异，其中MARCKSL1、BASP1、MARCKS和PTGFRN在EV中GFP表达水平最高。尽管非靶向细胞质GFP (cGFP)在细胞中的表达量是其他结构的10倍，但它仅在EV中表现出较弱的定位，这表明GFP在细胞中的丰富表达不足以被随机包装到EV中。

接下来，我们试图确定过表达的支架蛋白是均匀分布在EVs中还是富集在亚群中。纳米流式分析仪(NanoFCM)是一种专门用于分析小于可见光波长颗粒的流式分析仪，用于测定单个囊泡的GFP荧光。先前报道的表达GFP融合支架蛋白的细胞产生的EVs，GFP+囊泡从低(LAMP2B, pD, Palm: 10%-35%)到中等 (CD9, CD63, CD81: 50%-65%)，与MARKCSL1, BASP1, MARCKS和PTGFRN融合，产生明确的GFP+峰，95%的分析颗粒显示可检测到GFP荧光。结合ELISA检测结果，数据表明，MARCKSL1、BASP1、MARCKS或PTGFRN过表达可得到F1中EVs中大量、均匀分布。

三、 EV支架候选PTGFRN的表征

PTGFRN和IGSF8属于IgSF-EWI蛋白，一个I型跨膜糖蛋白家族，结构上由IgV串联结构域和短的胞质尾组成。尽管它们结构相似，但胞内IGSF8-GFP的表达在EVs中只出现少量的富集，而PTGFRN-GFP的表达则出现异常高的水平。

为了更好地理解定位EV的PTGFRN的特征，在预测的IgV域边界产生了一系列PTGFRN-GFP截段。大部分截段显示出与全长PTGFRN(FL)相似的细胞GFP表达水平；然而，截段D149-D537显示EV定位明显减少。使用针对胞内GFP标签的抗体对纯化的EVs进行免疫印迹分析，发现意外的55kDa膜结合产物为PTGFRN的截断形式。该产物也可以在FL支架中检测到，尽管水平较低。PTGFRN-GFP融合蛋白在细胞裂解液中基本完整，表明蛋白水解发生在EV生物发生过程中或释放后。因此，对这一蛋白水解事件进行表征并防止其发生可能有助于开发稳定的、高密度的表面工程EVs。

我们猜测丰富的EV蛋白酶ADAM10可能是导致PTGFRN截断的原因。瞬时转染FL-GFP和d395 - GFP后，用ADAM10敲除细胞系用于生产EVs。从ADAM10 KO细胞纯化的EVs中不包含在转染D395-GFP的野生型(WT)产生细胞中发现的55-kDa产物，这表明PTGFRN的截断形式易受位点特异性ADAM10裂解的影响。我们通过移除假定的切割位点，确定了一个PTGFRN截断对ADAM10蛋白水解具有抗性，导致每个EV的GFP比任何其他测试的截段更多。FL和PTGFRN优化后的Δ687截断形式都被用于进一步评价目标蛋白支架。

四、BASP1

尽管缺乏明显的序列同源性，但MARCKS、MARCKSL1和BASP1通过2位甘氨酸残基的n -末端肉豆酰化和一个多碱效应域与细胞膜内小叶相关联。当MARCKS和MARCKSL1的c端截断(只包含前30个氨基酸，去除多碱区域)降低了40%-80%的GFP结合。对BASP1进行类似的截断(只包含前30个氨基酸，但包含多碱基区域)，通过ELISA得到了与全长支架相当的水平。进一步定义所需的最小的序列用于EVs定位，我们做了一系列的增量BASP1截断融合GFP和观察大量加载全部结构至少包含最初的8个残基。这个最小肽序列只包含BASP1多基结构域10个赖氨酸残基中的3个。虽然EV定位需要一部分多基结构域，但这是不够的，因为豆粕酰化位点(G2A)的突变完全破坏了包含整个多基结构域的结构。这些数据表明，MARCKS家族蛋白需要脂质修饰和一个多碱序列来高密度载入EVs，这两者都可以被容纳在一个8-氨基酸肽中。

五、 PTGFRN可以使EV表面显示多种蛋白质

通过将一系列结构和生物多样性的蛋白融合到PTGFRN表面暴露的N端来作为其表达支架的评估。为了比较工程EVs的特异蛋白活性，根据EV浓度和绝对融合蛋白浓度，给出体外最大有效/抑制浓度(EC50/IC50)数据。通过下调CD8+T细胞上的IL-7受体(IL-7R)来检测，FL PTGFRN和截断的D687支架在EVs表面有效地显示了活性白细胞介素-7 (IL-7)，一种分泌的细胞因子。PTGFRN构建物每颗粒的效力是IL-7融合pD (EV工程中常用的支架)的250倍(IC50= 2.79E+8 [FL]， 3.99 e +8 [D687] vs 7.10E+10 ([pD] p/mL)。当归一化IL-7总量时，所有EVs结构显示出相似的ic50值。

TNFSF成员CD40配体(CD40L)是一种在活化的T细胞上瞬时表达的II型跨膜蛋白，它通过同型三聚体受体CD40来诱导信号传导。我们将单链三聚体CD40L胞外结构域(ECD) 与PTGFRN融合，用初级B细胞活性试验测定其效能。这些EVs具有比从CD40L过表达细胞中分离出的EVs高至少50倍的效力，显示了将治疗分子附加到EVs特异性支架的重要性(EC50= 1.12E+9 [FL]， 1.89E+9 [D687] vs 6.09E+10 [CD40L] p/mL)。此外，CD40L-FL EVs比单独使用重组CD40L ECD的效力强20倍，表明在生物膜中呈现这些分子可能会增强信号传导(EC50= 1.02 [FL] vs 19.7 [Rec.] ng/mL)。相同方法用于评估另一个TNFSF成员，LIGHT， 证明了PTGFRN作为展示TNFSF配体的EV支架的多功能性。

为了探索在EVs上显示抗体片段等靶向配体的可行性，我们将靶向免疫细胞的单链抗原结合(scFab)和可变(scFv)片段分别添加到两种PTGFRN支架上，包括小鼠145-2C11抗cd3 ε抗体。抗cd3抗体是一种有效的免疫抑制剂和耐受性诱导剂，用于通过CD3ε结合减轻器官移植排斥反应的症状。与可溶性抗cd3抗体相比，EVs与FL和Δ687 PTGFRN融合后修饰的抗CD3 scFab同样下调了原代小鼠CD4+ T细胞上T细胞受体(TCR)的表达。通过PTGFRN融合在EVs表面显示scFv、scFab或单域VHH形式，进一步证明了该体系的多功能性。

IL-12是由抗原呈递细胞(APCs)自然产生的，作为一种稳定相关的异二聚体，并通过刺激肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞分泌干扰素γ (IFNg)来提供抗肿瘤免疫。我们构建了一个将PTGFRN融合到由p35和p40的亚基由一个柔性的连接器连接组成的单链版本的人IL-12。与FL或D687 PTGFRN融合的结果与IFN在外周血单个核细胞有相似效能(PBMCs;EC50= 4.23E+8 [FL] vs 6.70E+8 [Δ687] p/mL)。当归一化到IL-12浓度时，IL-12-FL EVs和重组IL-12表现出相似的效价(EC50= 0.277 [FL] vs 0.269[Rec.] ng/mL)，比D687-IL-12强6倍(EC50= 1.77 ng/mL)。虽然我们观察到供体与供体之间的显著差异，但在每个供体内部，治疗组之间的相对EC50值保持一致。这些IL-12构建物的小鼠模型也被建立，在100和200 ng剂量的重组小鼠IL-12或EV当量IL-12剂量下，在同基因B16F10黑色素瘤模型中评估了抗肿瘤活性。与重组IL-12相比，瘤内给予小鼠IL-12- FL EVs改善了肿瘤生长抑制和生存。

结果就展示这么多，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，或者私聊我要文献资料，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Dooley, K; McConnell, RE; Xu, K; et al.A versatile platform for generating engineered extracellular vesicles with defined therapeutic properties.[J].Mol Ther.2021,29(5):1729-1743

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